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    基金项目:科技部“十一五”国家科技支撑计划(2006BAK02A21)。基金项目:项目来源“项目名称”(项目编号)。

    第一作者简介:职爱民,男,1976年出生,河南新乡人,副研究员,博士,研究方向为食品安全检测与营养免疫。通信地址:450002 河南郑州金水区农业路1号,河南省农业科学院免疫室,Tel:0371-65737806,E-mail:aiminzhi@126.com。第一作者简介:姓名,性别,出生年,籍贯,职称,学历,学位,研究方向及学术成就。通信地址:邮政编码具体地址、单位(需是能确保您收到编辑部将寄给您发票、期刊等信函的地址),Tel:区号-000000,E-mail:***@*****。

    通讯作者简介:张改平,男,1960年出生,河南内黄人,研究员,博士,中国工程院院士,主要从事动物免疫学和兽药残留研究。E-mail:zhanggaiping2003@yahoo.com.cn。通讯作者(若没有通讯作者或通讯作者与第一作者为同一人,则不需要此简介):姓名,性别,出生年,籍贯,职称,学历,学位,研究方向及学术成就。通信地址:邮政编码 具体地址、单位(需是能确保您收到编辑部将寄给您发票、期刊等信函的地址),Tel:区号-000000,E-mail:***@*****。

    收稿日期:2010-02-01,修回日期:2010-04-25。

    (以上内容写于题目前即可,不必设为脚注(六号宋体)。)

     

    环丙沙星单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定(小二宋居中)

    职爱民1,张  杰2,张改平1

    (宋体五号居中,人名间用逗号隔开,单名的姓和名之间空2格,作者单位序号右上标格式,英文同)

    1河南省农业科学院 农业部动物免疫学重点开放实验室,郑州 450002;

    2河南花花牛乳业股份有限公司,河南新乡 450002)

    (宋体小五号居中,单位序号左上标,单位所在城市若为省会城市不必要写出省份,如不是,必须写出省份。如:河北保定。英文同)

    摘  要:[目的] 研究旨在应用CIP人工抗原免疫BALB/c小鼠,建立分泌抗CIP单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株,以期为免疫学检测方法的建立和拥有自主知识产权检测产品的开发奠定基础。[方法]用EDC法将BSA和OVA分别和环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)偶联作为免疫原和包被原,并经紫外扫描 (UV Scan)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。用合成的BSA-CIP免疫BALB/c小鼠,经过3次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌CIP单克隆抗体的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备CIP mAb,对CIP mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。[结果]聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表明BSA-CIP人工抗原偶联成功;免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-4;其中2号小鼠血清CIP抑制效价较高且IC50最低,达48.59 μg/L,融合后筛选出Z3G12B3和Z2H8C10两株敏感特异的杂交瘤细胞,其两株细胞培养上清液效价为1:512,腹水效价为1:2.56×105,Z3G12B3株对CIP的IC50为2.47 μg/L,与二氟沙星、沙拉沙星有小于0.03%的交叉反应性,与其他抑制物无交叉反应性。[结论]该试验获得了高效价、敏感、特异的抗CIP mAb,为CIP残留ELISA检测试剂盒和试纸条的建立奠定了坚实的基础。

    (宋体五号) (摘要中(目的)、(方法)、(结果)、(结论)等字样必须写,便于审查是否遗漏写作要素,排版时会删除。作者必须使删除后行文通顺,流畅。)

    关键词:环丙沙星;半抗原;单克隆抗体

    (用实词3~8个,勿用虚词,之间用分号隔开)

    中图分类号 (查询网址:http://www.ztflh.com/):S859.84             文献标志码:A     论文编号:2010-0337

    Generation and Immunological Traits of Monoclonal Antibody for Ciprofloxacin

    Zhi Aimin1, Zhang Jie2, Zhang Gaiping1

    (Times New Roman五号居中)

    (1Key Laboratory for Animal Immunology of the Ministry of Agriculture, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002; 2Henan Huahuaniu Dairy Co. Ltd., Xinxiang Henan 450002)

    (Times New Roman小五号居中)

    Abstract: [Objective][Method] The Ciprofloxacin (Ciprofloxacin, CIP) was conjugated to carrier protein BSA and OVA by EDC to obtain the artificial and coating antigen. The ultraviolet scanning and SDS-PAGE were used to identify Ciprofloxacin artificial antigen. BALB/c mice were immunized with BSA-CIP. The titer of polyclonal antibody (pAb) was detected by indirect ELISA and blocking ELISA after three times immunization. The high titer, sensitive and specific mouse was selected for cell fusing. [Result]The hybridoma lines that secrete CIP mAb were established with using monoclonal antibody hybridoma technology and the immunological characteristics such as titer, sensitivity and specificity of the mAb were characterized. SDS-PAGE results showed that CIP artificial antigen was synthesized successfully. Three BALB/c mice indirect ELISA titer against CIP were all above 10-4 and the IC50 of No. 2 mice was 48.59 μg/L. Two hybridoma cell lines of Z3G12B3 and Z2H8C10 were screened for specificity to CIP after cell fusing, the indirect ELISA titer of the mAb were 1:512 in supernatant, 1:2.56×105 in ascites, the mAb of Z3G12B3 showed good sensitivity with an IC50 of 2.47 μg/L to CIP, had less than 0.03% cross-reactivity with sarafloxacin and difloxacin, and no cross-reactivity to other compounds. [Conclusion]The high-titer, sensitive and specific CIP mAb has been generated and laid a solid foundation for the CIP ELISA kit and strip.

    ((Objective),(Method),(Result),(Conclusion)等字样必须有)

    Key words: Ciprofloxacin; hapten; monoclonal antibody; hybridoma; immunological traits

    (Times New Roman五号,分号隔开,首字母小写,专用名词除外)

    正文不分栏,小标题及其内容均宋体五号,单倍行距,字间距为标准间距,英文、数字用五号Times New Roman;变量符号要用斜体,大小写全文要一致;图表内容只需中文即可,图表采用嵌入式格式。

    文中物种的学名:菌株的属名、种名(包括亚种、变种)用拉丁文斜体。属的首字母大写,其余小写,属以上用拉丁文正体。病毒一律用正体,首字母大写。

    限制性内切酶:前三个字母用斜体,后面的字母和编码正体平排,例如:BamHI、EcoRI、MspI、Sau3AI等。

    氨基酸和碱基的缩写:氨基酸缩写用3个字母表示时,仅第一个字母大写,其余小写,正体。碱基缩写为大写正体。基因符号用小写斜体,蛋白质符号首字母大写,用正体。)

    0  引言

    [研究的重要意义]环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP),又名丙氟哌酸、悉复欣、环丙氟哌酸、悉复欢和适普灵等。CIP为合成的第三代喹诺酮类抗菌药物,具广谱抗菌活性,杀菌效果好,几乎对所有细菌的抗菌活性均较诺氟沙星及依诺沙星强2~4倍,对肠杆菌、绿脓杆菌、流感嗜血杆菌、淋球菌、链球菌、军团菌、金黄色葡萄球菌具有抗菌作用[1](参考文献按正文中首次引用的先后顺序连续编码,序号置于方括号中、以上标格式标注在正文引用处)。CIP临床主要用于敏感菌所致的呼吸道、泌尿道、消化道、皮肤软组织等的感染及胆囊炎、胆管炎等治疗。由于其卓越的抗菌性能,在畜牧业生产中被药物饲料添加剂广泛的应用。[前人研究进展]然而CIP进入畜禽机体后,消除比较缓慢[2],其引起的残留问题日益受到各国政府的关注。目前检测CIP残留的方法多是高效液相色谱(HPLC)[3-5]、液质联用(HPLC-MS)[6-7]和薄层色谱(TLC)[8]等理化方法。理化检测方法具有所用仪器昂贵、样品前处理复杂、繁琐费时、不能现场操作等缺陷,限制了其应用。[研究切入点]免疫学分析方法具灵敏、快速、特异、简便等优点,近年来在兽药、农药残留检测领域已被广泛应用[9-11],代表了现场筛查方法的研发方向。[拟解决的关键问题]该研究旨在应用CIP人工抗原免疫BALB/c小鼠,建立分泌抗CIP单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株,以期为免疫学检测方法的建立和拥有自主知识产权检测产品的开发奠定基础。((本研究的重要意义),(前人研究进展),(本研究切入点),(拟解决的关键问题)字样必须有)

    1  材料与方法

    1.1  试剂、试验动物和细胞

    盐酸环丙沙星,购自Sigma公司,纯度>98%;BSA、OVA购自Pierce公司;佐剂FCA、FIA,细胞培养基RPMI-1640,选择培养基HAT、HT,PEG-1500,Gibco产品;3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB),Sigma产品;新生牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司产品;羊抗鼠酶标二抗(GaMIgG-HRP),华美生物工程有限公司产品;其他试剂市售所得,均为AR级。6周龄SPF级BALB/c小鼠,农业部动物免疫学重点开放实验室自繁自养,小鼠骨髓瘤细胞株NS0由英国国家动物健康研究院惠赠。试验在河农业部动物免疫学重点开放实验室,于2008年12月—2009年5月份进行。(研究性论文必须有具体试验时间与地点)

    1.2  主要仪器

    550型酶标仪,美国Bio-Rad公司生产;DU-600核酸蛋白分析仪,德国BECKMAN公司生产; 3K-18高速冷冻离心机,德国SIGMA公司生产;凝胶成像系统及分析软件,Syngene公司产品;AE260电子天平,德国METTLER公司生产;HI9321酸度计,美国HANNA公司生产;JM-250电泳仪,大连捷迈科贸公司生产;SZ-93自动双重纯水蒸馏器,93-3定时恒温双向磁力搅拌器,上海亚荣生化仪器厂生产。

    1.3  人工抗原的合成与鉴定

    1.3.1  人工抗原的合成  采用碳二亚胺(EDC)法合成BSA-CIP完全抗原。称取10 mg CIP和15 mg BSA分别溶于1 mL PBS中,并混合均匀,搅拌条件下溶解1 h,此为A液。取EDC 30 mg 溶于1 mL PBS中,此为B液。将B液逐滴加入A液中,室温搅拌反应24 h。将反应产物装入透析袋PBS透析3天,每8 h换液1次,透析后分装于-20 ℃贮存备用。同法制得包被抗原OVA-CIP。

    1.3.2  人工抗原的鉴定

    (1)UV鉴定  用PBS配制CIP和BSA标准溶液,取一定量的BSA-CIP溶于PBS,用Braford法测定其蛋白质的浓度,据此浓度调节BSA-CIP溶液中BSA的浓度与BSA标准溶液一致,在波长200~400 nm范围内进行紫外扫描,根据吸收波峰情况判断偶联情况。

    正文部分设四级标题,分别为

    1

    1.1

    1.1.1

    (1)四级标题用圆括号加数字表示

    (2)SDS-PAGE鉴定  参照郭尧君[12]方法进行试验,浓缩胶为5%(W/V),分离胶为10%(W/V),浓缩电压为80 V,分离电压为40 V,上样量为10 μL,考马斯亮蓝染色5~6 h后,置脱色液中脱色过夜。

    1.4  小鼠多抗血清(pAb)效价测定

    1.4.1  小鼠免疫  无菌PBS稀释BSA-CIP免疫原至500 μg/mL(数与单位之间空1格,符合单位采用斜线格式。英文同),和等量FCA混合,充分乳化后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠3只,免疫剂量为0.2 mL/只,背部皮下分4~6点注射。加强免疫于首免后2周进行,将PBS溶解的BSA-CIP与等量FIA混合,共免4次,每次间隔2周,最后1次免疫后第8~12天断尾采血分离血清。用间接ELISA检测抗CIP抗体效价,若效价>1.0×10-3即可用于细胞融合;最后1次加强免疫后4周,细胞融合前4天进行超强免疫,用无菌PBS溶解BSA-CIP,腹腔注射BSA-CIP 50 μg/只,注射体积为0.2 mL。

    1.4.2  小鼠抗血清效价、敏感性测定  间接ELISA测定pAb的效价,阻断ELISA测定其对CIP的抑制,基本程序参照Tijssen[13]的方法,具体如下:OVA-CIP用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释到1 μg/mL,50 μL/孔包被酶标板,4 ℃过夜,PBST洗板3次用后5%猪血清封闭200 μL/孔,37 ℃温育1 h,洗3次;加稀释至1 000倍的mAb,50 μL/孔,用封闭液倍比稀释,设阴性对照(NC)和空白对照(BC),37 ℃温育15 min,洗3次;加GaMIgG-HRP,用封闭液稀释至1:1000,50 μL/孔,37 ℃温育15 min,洗6次;加酶底物TMB显色50 μL/孔,室温反应10 min;加入终止液终止反应,读OD450值;结果判断:以待测孔OD450值≥NC OD450值的2.1倍(P/N≥2.1),判为阳性。

    1.5  杂交瘤细胞株的建立

    1.5.1  融合鼠选择  用间接阻断ELISA检测多抗血清的抑制价,选取抑制最好的作为融合用鼠,其他作为备用小鼠。

    1.5.2  细胞融合  用1640完全培养液培养NS0骨髓瘤细胞,于融合前2天传代培养;融合前1天制备小鼠饲养细胞;小鼠超强免疫后第4天,摘除眼球,眶下窦采血,分离阳性血清;脱颈致死小鼠,无菌取脾脏制备脾细胞,在50% PEG-1500作用下与NS0细胞融合;将融合后的细胞悬液加到已铺有饲养细胞层的96孔细胞培养板中,加入HAT培养液后置于37 ℃ 5% CO2培养箱培养。

    1.5.3  融合细胞的培养及阳性杂交瘤的筛选与克隆  融合细胞于第10天用HT培养液半量换液;用间接ELISA和阻断ELISA进行阳性孔筛选,选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化,而后扩大培养、冻存、鉴定和建株。

    1.5.4  mAb生产  体内诱生腹水法生产mAb[14]。将建株后的细胞扩大培养,待细胞数量达到1×106个/mL,收集并测定ELISA效价;将经产BALB/c小鼠腹腔注入灭菌液体石蜡0.5 mL/只,第10天后注入克隆化阳性细胞(3~6)×106个/只,第15天左右抽取腹水,用饱和硫酸铵盐析法纯化mAb。

    1.6  mAb免疫学特性鉴定

    1.6.1  效价测定  间接ELISA测定其效价。

    1.6.2  敏感性鉴定  用阻断ELISA测定mAb对不同浓度CIP的抑制率,以吸光率B/B0(B是CIP不同浓度的OD450值,B0是CIP 0标准浓度的OD450值)为纵坐标,以不同浓度CIP的对数值为横坐标,绘制标准抑制曲线,进行相关回归分析,计算mAb对CIP的IC50

    1.6.3  特异性鉴定  用CIP及其同系喹诺酮类药物作为抑制剂,用阻断ELISA测定各抑制物的IC50,以mAb对CIP的IC50与各抑制物的IC50之比的百分数为其交叉反应率(CR%)[15]

    1.6.4  同种型及亚类鉴定  采用间接ELISA检测方法,按鉴定试剂盒说明进行操作。

    2  结果

    2.1  人工抗原鉴定结果

    UV鉴定结果见图1。图1(所有图表应在正文中标明,并置于引用处正文下方)表明,BSA的特征峰在278 nm,CIP的最大吸收峰在272 nm,325 nm处亦有其一特征峰。BSA与CIP偶联后,280 nm处两者的峰叠加,325 nm处亦有CIP特征峰出现,表明偶联成功;SDS-PAGE鉴定结果见图2。图2表明,BSA的泳动速度大于BSA-CIP,说明BSA-CIP的分子量大于BSA,证明偶联成功。

    图1  BSA、CIP和BSA-CIP的紫外扫描光谱

    (扫描图确保数值清晰可读。图中坐标轴题目不能省略,格式参照“叶绿素含量/(mg/g)”或“相对电导率/%”等)

    1.Marker;2.BSA;3.BSA-CIP(图注放在图名上方)

    图2  BSA-CIP偶联的SDS-PAGE鉴定(图表名用小五号宋体)

    2.2  小鼠血清效价敏感性测定结果

    间接ELISA效价见表1,IC50结果见图3。表1可知,免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到了10-4,获得了较好的免疫效果,其中2号鼠血清效价较高且IC50最低,选作细胞融合用。

    表1  小鼠四免后第15天间接ELISA测小鼠血清效价

    序号 抗血清稀释倍数 阴性对照 空白对照
    200 400 800 1600 3200 6400 12800
    1 2.397 1.927 1.282 0.986 0.786 0.404 0.231 0.070 0.065
    2 2.623 1.824 1.004 0.876 0.612 0.389 0.267 0.069 0.061
    3 2.210 1.876 0.998 0.854 0.604 0.384 0.231 0.071 0.059

    (宋体六号,网状表格,三线表(行与行、列与列之间要有表格线隔开)。表中内容原则上不能有空格,表内空白代表未测或无此项,“—”或“…”代表未发现,“0”代表实测结果为零)

     

    图3  1号小鼠血清(pAb)对CIP的阻断ELISA抑制曲线

    (图内容9号或六号字。数据图用Excel软件制作,并带上数据库(带数据库的方法:先在Excel里生成图,复制,然后打开Word正文,在“编辑”下拉菜单中选“选择性粘贴”点击Microsoft excel 图表对象)。

    检查是否带数据库的方法:打开Word正文,双击图,带Excel数据即可)

    2.3  杂交瘤细胞株的建立

    细胞融合后第10天观察融合效果,4块细胞培养板共形成杂交瘤克隆286孔,融合率为74.5%;间接ELISA检测,强阳性19孔,强阳性率为6.6%;3次亚克隆后获得2株杂交瘤,分别测定其IC50并命名为Z3G12B3、Z2H8C10,经多次传代、冻存及复苏,杂交瘤细胞分泌抗体稳定。

    2.4  mAb免疫学特性鉴定结果

    2.4.1  效价测定结果  由表2可知,杂交瘤分泌的抗CIP mAb具有较高的效价,2株杂交瘤Z3G12B3、Z2H8C10株效价相似,细胞培养上清和腹水效价分别达到了1:5.12×102和1:2.56×105

    表2  CIP mAb的间接ELISA效价

    单克隆抗体

    上清

    腹水

    Z3G12B3

    1:5.12×102

    1:2.56×105

    Z2H8C10

    1:5.12×102

    1:2.56×105

    2.4.2  敏感性鉴定结果  敏感性鉴定结果见图4。Z3G12B3 mAb标准抑制曲线的线性回归方程为y=-37.043x+85.918,根据回归方程计算出Z3G12B3 mAb对CIP的IC50为2.52 μg/L,该试验所获mAb对CIP具有较高的敏感性。

    图4  阻断ELISA检测CIP IC50

    2.4.3  交叉反应试验结果  交叉反应试验结果见表3。表3可知,CIP的IC50为2.47 μg/L,CIP mAb对二氟沙星有0.027%的交叉反应性,对沙拉沙星有小于0.02%的交叉反应性,对其他抑制物无交叉反应。

    表3  CIP mAb与其他药物的交叉反应

    化合物

    半数抑制浓度/(μg/L)

    交叉反应性/%

    环丙沙星

    2.47

    100

    二氟沙星

    >9.0×103

    0.027

    沙拉沙星

    >1.2×103

    0.02

    链霉素

    >3.2×103

    <0.01

    氨苄青霉素

    >3.2×103

    <0.01

    莱克多巴胺

    >3.2×103

    <0.01

    磺胺甲基嘧啶

    >3.2×103

    <0.01

    新霉素

    >3.2×103

    <0.01

    2.4.4  同种型及亚类鉴定  用Sigma公司的小鼠抗体同种型间接ELISA检测试剂盒鉴定,Z3G12B3和 Z2H8C10同种型分别为IgG1和IgG2a。

    3  结论

    是全文的归结,是试验、观测结果和理论分析的逻辑发展。可以是中心思想的重申和主要观点的归纳,可以是具有启发性的解释,或是在研究结果基础上的预测。应单独成段,简明、扼要。条理清晰地将本研究的主要结果概况为基本结论,以便他人引用。

    1.本研究结果说明了什么问题,得出了什么规律性的东西,解决了什么理论或实际问题;

    2.对前人有关本问题的看法作了那些检验,那些与本研究结果一致,那些不一致,作者做了那些修正、补充、发展或否定;

    3.本研究的不足之处或遗留问题

    容易出现的问题:结论混同为结果,以结论代替结果,结论和结果不分或分不清。

    4  讨论

    环丙沙星是小分子药物抗原,本身不具有免疫原性,需要和载体蛋白偶联形成具有免疫原性的人工免疫原。根据CIP的化学结构,制备CIP人工抗原可以选用的连接方法可以选用戊二醛法和EDC法等,课题组采用EDC法偶联了CIP-BSA,由于EDC法是零长度连接桥,有效的避免了桥抗体的出现,保证了生产抗体的特异性。动物体内诱生法是目前比较经济、高效和广泛应用办法,在动物的选择上,课题组选择经产的BALB/c雌鼠。在接种杂交瘤细胞的前10天左右,给小鼠注射液体石蜡、降植烷或者弗氏不完全佐剂,其原理是液体石蜡等腹水刺激剂能有效抑制小鼠巨噬细胞和淋巴细胞的免疫功能,使小鼠能更好的接纳腹腔中具有恶性生长特性的杂交瘤;农业部动物免疫学重点开放实验室采用无菌液体石蜡预处理小鼠,6天后注射杂交瘤,12天后收集腹水,获得较好的效果。该研究成功通过杂交瘤技术获得2株高亲和力和高特异性的杂交瘤细胞,经多次传代、冻存与复苏,杂交瘤分泌抗体稳定,制备出的效价高、敏感性和特异性强抗CIP的单克隆抗体。CIP mAb的成功制备为CIP残留的免疫学检测方法的建立奠定了坚实的基础。

    参考文献

    列出与文章切实相关的国内外资料,特别要吸收国内外最近5年文献;

    研究论文引用参考文献数量不应低于25篇,综述不应低于50篇;

    未公开发表的文献不宜引用;

    使用半角状态的标点符号,按[1]、[2]、[3]等顺序排列;

    请严格按模板格式编写,特别注意英文字与字(或字母)之间、标点符号与字之间、标点符号与数字之间的空格;

    参考文献用6号宋体

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    参考文献格式模板

    [1]  期刊

    [序号]  作者(不超过3人者全部写出,超过者只写前3名,后加“等”或“et al.”).文题.期刊名,年,卷(期):起止页码.

    例: [1]  昝林森,郑同超,马陕红,等.牛肉安全生产可追溯信息系统研究与应用[J].中国农学通报,2006,22(8):22-25.

    [2]  书籍

    [序号]  作者.书名.译者.版次(第1版不写).出版地:出版单位(国外出版单位可用标准缩写不加缩写点),出版年:起止页码.

    例: [2]  黄蕴慧.国际矿物学研究的动向[M].北京:地质出版社,1982:39-39.

    [3]  论文集

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    [4]  [学位论文]

    [序号]  作者.题名:[学位论文].保存地点:保存单位,年份:起止页码.

    例: [4]  李庆忠.高速犁体曲面的优化设计:[D].北京:北京农业工程大学,1998:27-33.

    [5]  电子文献

    [序号]  主要责任者.电子文献题名[电子文献及载体类型标识].电子文献的出处或可获得地址,发表或更新日期/引用日期(任选).

    例: [5]    王明亮.米象和赤拟谷盗不同品系成虫的磷化氢击倒时间与其抗性之间的关系[EB/OL]. Http://www.cajcd.edu./cn/ pub/wl.txt/980810-2.html,1998-08-16/1998-10-04.

    [6]  报纸

    [序号]  作者.题名.报纸名,年-月-日(版次)

    例: [6]  谢希德.创造学习的新思路[N].人民日报,1998-12-25(10).

    [7]  技术标准

    [序号]  起草责任者.标准代号 标准顺序号—发布年,标准名称.出版地:出版者,出版年:引文所在的起始或起止页码.

    例: [7]  农业部农机鉴定总站,广西农机鉴定站,湖南农机鉴定站,等.GB5667—85,农业机械生产试验方法[S].北京:中国标准出版社,1986:32.

    [8]  专利文献

    [序号]  专利申请者.题名.专利国别,专利文献种类,专利号.出版日期.

    例: [8]  曾德超.常速高速通用优化犁[P].中国专利,85203720.1,1986-11-13.

    [9]  书籍(专著)析出的文献

    [序号]  作者.题名.见(英文用In):原文献责任者.书名.版本.出版地:出版者,出版年.在原文献中的起始或起止页码.

    例: [9]  黄蕴慧.国际矿物学研究的动向.见:程裕淇编.世界地质科技发展动向[M].北京:地质出版社,1982:39-39.https://author.cnki.net/#/indexhttps://author.cnki.net/#/indexhttps://author.cnki.net/#/indexhttps://author.cnki.net/#/indexhttps://author.cnki.net/#/indexhttps://author.cnki.net/#/indexhttps://author.cnki.net/#/indexhttps://author.cnki.net/#/index

  • 发布日期:2020-03-22 浏览: 21504