基于BSA-seq技术的青花菜花球蜡质基因初定位及鉴定研究

doi:10.11924/j.issn.1000-6850.casb2023-0901

中国农学通报 ›› 2024, Vol. 40 ›› Issue (33): 131-140.doi: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb2023-0901

基于BSA-seq技术的青花菜花球蜡质基因初定位及鉴定研究

陶美奇(), 张振超(), 潘永飞, 孙国胜, 许丁帆, 山溪, 姚悦梅

江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，江苏句容 212400

收稿日期:2023-12-29 修回日期:2024-04-15 出版日期:2024-11-25 发布日期:2024-11-23
通讯作者:
张振超，男，1981年出生，安徽淮北人，副研究员，博士，研究方向：十字花科蔬菜遗传育种。通信地址：212400 江苏省句容市弘景路1号，江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，Tel：13921553937，E-mail：zzc1981zzc@163.com。
作者简介:
陶美奇，女，1995年出生，黑龙江绥化人，研究实习员，硕士，研究方向：十字花科蔬菜遗传育种。通信地址：212400 江苏省句容市弘景路1号，江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，Tel：15805197889，E-mail：810998804@qq.com。
基金资助:
江苏省种业振兴揭榜挂帅项目“优质多抗特色青花菜新品种选育”(JBGS(21)077); 镇江市重点研发项目“优质高产抗病设施栽培青花菜新品种选育”(NY2023022); 句容市科技项目“优质中熟耐败蕾青花菜新品种选育及栽培技术集成与示范”(ZA32209); 镇江市农业科学院青年基金项目“青花菜花球表面蜡粉缺失控制基因精细定位”(QNJJ2021003)

Wax Genes in Broccoli Curd: Primary Localization and Identification Based on BSA-seq Technology

TAO Meiqi(), ZHANG Zhenchao(), PAN Yongfei, SUN Guosheng, XU Dingfan, SHAN Xi, YAO Yuemei

Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences in Hilly Area of Jiangsu Province, Jurong, Jiangsu 212400

Received:2023-12-29 Revised:2024-04-15 Published:2024-11-25 Online:2024-11-23

摘要/Abstract

摘要：

为了发掘调控青花菜花球蜡质合成的相关基因，以青花菜有蜡粉野生型(WT20)为父本，无蜡粉突变体(MT20)为母本构建F₂群体，基于F₂构建极端有蜡混池和无蜡混池，利用BSA-seq技术对亲本混池和F₂极端混池进行混池测序，通过ΔSNP-index算法初步定位与蜡质合成关联的区间，根据基因注释信息预测候选基因，并采用qRT-PCR分析候选基因在亲本中的表达情况。结果表明F₂分离群体中有蜡粉株与无蜡粉株分离比为2.87:1，符合单基因隐性核基因遗传规律；两个混池间共获得高质量SNP位点2,045条、InDel位点687条，基于SNP-index关联分析将候选基因定位在4号、7号和8号染色体的3个区间，包含93个基因。进一步对候选区域内的基因进行KEGG、GO、GOC数据库分析发现0.12 Mb和1.07 Mb的区段内92个基因获得注释，对区间内可能跟蜡质合成相关的11个基因进行定量分析，筛选出4个差异显著表达基因BoAPC3、BoCDH1、BoEEF1A和BoAHP4。本研究结果可以为进一步研究青花菜蜡质合成通路提供新思路，以及为选育高品质青花菜奠定基础。

关键词: 青花菜, 蜡质, BSA-seq, 初定位, 鉴定, 候选基因

Abstract:

In order to explore the related genes regulating the synthesis of wax in broccoli flower bulbs, the F₂ population was constructed using the broccoli waxy wild type (WT20) as the male parent and the waxless mutant (MT20) as the female parent. Based on F₂, extreme wax-pool and no-wax-pool were constructed. The parent pools and F₂ extreme pools were sequenced by BSA-seq technology. The intervals associated with wax synthesis were initially located by theΔSNP-index algorithm. Candidate genes were predicted based on genes annotation information, and the expression of the candidate genes in the parents was analyzed by qRT-PCR. The results showed that the segregation ratio of wax-powdered plants to no-wax-powdered plants in the F₂ segregation population was 2.87:1, which conformed to the genetic law of single-gene recessive nuclear genes. A total of 2,045 high-quality SNP loci and 687 InDel loci were obtained between the two pools. Based on SNP-index association analysis, the candidate genes were located in three intervals on chromosomes 4, 7 and 8, including 93 genes. Further analysis of genes in the candidate regions in KEGG, GO, and GOC databases revealed that 92 genes in the 0.12 Mb and 1.07 Mb segments were annotated. Quantitative analysis was performed on 11 genes that might be related to wax synthesis in the intervals, and 4 differentially significantly expressed genes, BoAPC3, BoCDH1, BoEEF1A, and BoAHP4, were screened out. The results of this study can provide new ideas for further research on the wax synthesis pathway of broccoli, and lay a foundation for the breeding of high-quality broccoli.

Key words: broccoli, wax, BSA-seq, initial positioning, identification, candidate gene

陶美奇, 张振超, 潘永飞, 孙国胜, 许丁帆, 山溪, 姚悦梅. 基于BSA-seq技术的青花菜花球蜡质基因初定位及鉴定研究[J]. 中国农学通报, 2024, 40(33): 131-140.

TAO Meiqi, ZHANG Zhenchao, PAN Yongfei, SUN Guosheng, XU Dingfan, SHAN Xi, YAO Yuemei. Wax Genes in Broccoli Curd: Primary Localization and Identification Based on BSA-seq Technology[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2024, 40(33): 131-140.

图/表 13

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引物名称	引物序列(5’-3’)	引物名称	引物序列(5’-3’)
Actin-F	AGGCTACACGTTCGGACAAG	qRAD51L3-F	GAAGGAGGGTATCACTGTGA
Actin-R	TGGGGCACTAAACACAGTCA	qRAD51L3-R	TGTCAGCTGACCCTCACGGT
qAHP4-F	GTTGAAGAAGTTGCCACATT	qECA1-F	TCTCACCTACGGATATCGAC
qAHP4-R	TACTCGCACCAATGCTGGTG	qECA1-R	CTACGGAGATAACACTAGCG
qCDH1-F	GTAACTGAGTTCAGTTCAGT	qCNOT2-F	TGAGCAGGGCTTTGATCTCT
qCDH1-R	CGCAAGGAACATAAATCGGT	qCNOT2-R	CCTGCTCATTAAGCCTCCAC
qAPC3-F	CTCGCTCATCAAAAGTCTCC	qAPX1-F	CGCTGAGAAGCACTGCACAC
qAPC3-R	CTAGAGATCCTCCTCGGTCT	qAPX1-R	ACACCAGCAAGCTGATGGAA
qNUP35-F	GGTTCAGAGGCAGGTTATAC	qEEF1A-F	ATGGGTAAAGAGAAGTTTCA
qNUP35-R	TCCTTGGACCAGGAACATGT	qEEF1A-R	GACCTCTTGTTCATCTCAGC
qRABG3E-F	GATATGGGACACGGCTGGTC	qNQR-F	GCGGTTACATGCCCATGGAC
qRABG3E-R	CTGGATCAGAAACTCTTCCC	qNQR-R	GTTCTTTTGCGGGAACCTGA

引物名称	引物序列(5’-3’)	引物名称	引物序列(5’-3’)
Actin-F	AGGCTACACGTTCGGACAAG	qRAD51L3-F	GAAGGAGGGTATCACTGTGA
Actin-R	TGGGGCACTAAACACAGTCA	qRAD51L3-R	TGTCAGCTGACCCTCACGGT
qAHP4-F	GTTGAAGAAGTTGCCACATT	qECA1-F	TCTCACCTACGGATATCGAC
qAHP4-R	TACTCGCACCAATGCTGGTG	qECA1-R	CTACGGAGATAACACTAGCG
qCDH1-F	GTAACTGAGTTCAGTTCAGT	qCNOT2-F	TGAGCAGGGCTTTGATCTCT
qCDH1-R	CGCAAGGAACATAAATCGGT	qCNOT2-R	CCTGCTCATTAAGCCTCCAC
qAPC3-F	CTCGCTCATCAAAAGTCTCC	qAPX1-F	CGCTGAGAAGCACTGCACAC
qAPC3-R	CTAGAGATCCTCCTCGGTCT	qAPX1-R	ACACCAGCAAGCTGATGGAA
qNUP35-F	GGTTCAGAGGCAGGTTATAC	qEEF1A-F	ATGGGTAAAGAGAAGTTTCA
qNUP35-R	TCCTTGGACCAGGAACATGT	qEEF1A-R	GACCTCTTGTTCATCTCAGC
qRABG3E-F	GATATGGGACACGGCTGGTC	qNQR-F	GCGGTTACATGCCCATGGAC
qRABG3E-R	CTGGATCAGAAACTCTTCCC	qNQR-R	GTTCTTTTGCGGGAACCTGA

材料	株高/cm	开展度/cm	外叶数	最大叶宽×长(cm×cm)	花球直径/cm	单球重/g
WT20	48.3±2.6	63.4±2.4	16.5±1.5	25×48	14.6±1.4	502.6±2.6
MT20	34.6±1.7	41.8±2.1	10.7±1.3	15×32	4.8±0.6	96.5±3.1

材料	株高/cm	开展度/cm	外叶数	最大叶宽×长(cm×cm)	花球直径/cm	单球重/g
WT20	48.3±2.6	63.4±2.4	16.5±1.5	25×48	14.6±1.4	502.6±2.6
MT20	34.6±1.7	41.8±2.1	10.7±1.3	15×32	4.8±0.6	96.5±3.1

世代	总数	花球有蜡粉	花球无蜡粉	分离比率	卡平方测验	卡平方测验
P₁(MT20)	20		20
P₂(WT20)	20	20
F₁	30	30
F₂	267	198	69	2.87:1	0.101	3.84

基于BSA-seq技术的青花菜花球蜡质基因初定位及鉴定研究

Wax Genes in Broccoli Curd: Primary Localization and Identification Based on BSA-seq Technology

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样本	净数据	总数据量	Q30/%	GC含量/%	平均覆盖深度(X)	SNP数目	比对率/%	覆盖度/%
样本	净数据	总数据量	Q30/%	GC含量/%	平均覆盖深度(X)	SNP数目	比对率/%	1X	5X	10X
BWT20	82,295,454	24,688,636,200	90.38	37.86	73.85	5391641	91.97	87.89	85.04	82.74
BMT20	88,760,779	26,628,233,700	90.21	37.97	68.51	5432734	92.07	87.98	85.22	83.04
MT20	86,680,935	26,004,280,500	87.78	37.92	71.63	5594323	91.55	88.02	85.07	82.81
WT20	75,007,202	22,502,160,600	86.89	37.42	61.33	5468122	90.29	87.85	84.78	82.35

关联方法	染色体编号	区域起始位置	区域终止位置	区域大小/Mb	区域内基因数量
SNP-index	C04	38,722,939	38,845,950	0.12	14
SNP-index	C07	1,517,184	1,517,200	0.00	1
SNP-index	C08	340,610	1,407,991	1.07	78
总数					93

编号	青花菜ID	拟南芥ID	同源性	注释
BoECA1	Bol023403	AT1G07810	73.33%	ECA1，编码内质网型Ca²⁺泵送ATP酶
BoCNOT2	Bol023414	AT1G07705	81.33%	CNOT2，NOT转录复合物亚基2
BoKCS3	Bol023412	AT1G07720	88.70%	KCS3，参与VLCFA（超长链脂肪酸）生物合成的3-酮酰基-CoA合酶家族的一员
BoRAD51L3	Bol023410	AT1G07745	80.82%	RAD51L3，是SNI1的抑制剂，编码DNA重组和修复蛋白RecA/RAD51家族的一个成员
BoAPC3	Bol025432	AT3G16320	80.01%	APC3，促进复合体中的亚单位在整个生命周期中控制有丝分裂进程和细胞分化
BoNQR	Bol023447	AT1G49670	89.19%	NQR，结合/催化/氧化还原酶
BoCDH1	Bol025426	AT4G11920	76.27%	CDH1，促进复合体/环体的假定激活剂，该基因的突变导致茎尖分生组织发育异常，可能通过与WUS和CLV3的间接相互作用来调节分生组织的发育
BoAHP4	Bol025425	AT3G16360	89.52%	AHP4，参与组氨酸(His)-天冬氨酸(Asp)磷酸信号转导的含组氨酸磷酸递质，作为细胞分裂素信号传导的冗余阳性调节因子发挥作用
BoNUP35	Bol025433	AT3G16310	89.49%	NUP35，有丝分裂磷蛋白N^’端(MPPN)家族蛋白
BoEEF1A	Bol023420	AT1G07930	94.18%	EEF1A，GTP结合延伸因子Tu家族蛋白
BoRABG3E	Bol005744	AT1G49300	94.29%	RABG3E，编码一种参与膜运输的小GTP酶，过表达该基因的品系更能耐受高盐和高渗条件

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