淀粉磷酸化酶原核表达及单克隆抗体的制备

doi:10.11924/j.issn.1000-6850.casb16060044

中国农学通报 ›› 2017, Vol. 33 ›› Issue (14): 28-32.doi: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb16060044

所属专题：生物技术

淀粉磷酸化酶原核表达及单克隆抗体的制备

余厚美,安飞飞,罗秀芹,陈松笔,欧文军

中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部木薯种质资源保护与利用重点实验室,中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部木薯种质资源保护与利用重点实验室,中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部木薯种质资源保护与利用重点实验室,中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部木薯种质资源保护与利用重点实验室,中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部木薯种质资源保护与利用重点实验室

收稿日期:2016-06-08 修回日期:2017-05-09 接受日期:2016-08-25 出版日期:2017-05-25 发布日期:2017-05-25
通讯作者: 欧文军
基金资助:
中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(NO.0315014)、现代农业人才支撑计划

Starch Phosphorylase Prokaryotic Expression and Preparation of Monoclonal Antibodies

Received:2016-06-08 Revised:2017-05-09 Accepted:2016-08-25 Online:2017-05-25 Published:2017-05-25

摘要/Abstract

摘要： 旨在体外表达淀粉磷酸化酶，免疫小鼠制备单克隆抗体。用PCR扩增木薯淀粉磷酸化酶基因，将其克隆到原核表达载体(pET28a)中，经E.coli 表达纯化淀粉磷酸化酶。用纯化的淀粉磷酸化酶蛋白免疫Babl/c 小鼠，间接ELISA 测定小鼠血清效价，取小鼠脾细胞与小鼠SP2/0 细胞融合，制备能产生抗淀粉磷酸化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并检测其亚型和抗体稳定性。重组质粒在E.coli 中能高效表达淀粉磷酸化酶，免疫小鼠后取效价高的3#小鼠脾脏细胞和SP2/0 细胞融合，共获得15 株抗体效价均达到105以上，能稳定分泌抗淀粉磷酸化酶抗体的细胞株，与钙调蛋白、牛血清白蛋白无交叉反应，抗体亚型鉴定其中13 株为IgG 型抗体，其中2 株抗体性能非常稳定。本实验制备的淀粉磷酸化酶单克隆抗体效价高、特异性强、稳定性好，为后续木薯中淀粉磷酸化酶研究奠定基础。

关键词: 沙柳枝木, 沙柳枝木, 活性炭, 化学活化法, 吸附, 表征

Abstract: The aims are to express starch phosphorylase in vitro, and prepare monoclonal antibodies in immunized mice. Starch phosphorylase genes of cassava were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and then cloned into the prokaryotic expression vector (pET28a), the starch phosphorylase was expressed in E. coli and then purified. The purified starch phosphorylase was used to immunize Babl/c mice and the titer of mice serum was determined by indirect ELISA. Mouse spleen cells and murine SP2/0 cells were fused, and then hybridoma cell lines which could produce starch phosphorylase monoclonal antibody were prepared, the subtypes and stability of antibody were detected. Recombinant plasmid in E.coli could express starch phosphorylase efficiently, SP2/0 cells and spleen cells of 3# mice were fused, then 15 strains with antibody titer more than 105 were obtained, and the antibodies could against starch phosphorylase stably, and there was no cross reaction with calmodulin and bovine serum albumin, in which 13 strains were IgG type, and 2 strains were very stable. The monoclonal antibody of starch phosphorylase had high titer, strong specificity, and good stability, it could provide a basis for starch phosphorylase study on cassava.

余厚美,安飞飞,罗秀芹,陈松笔,欧文军. 淀粉磷酸化酶原核表达及单克隆抗体的制备[J]. 中国农学通报, 2017, 33(14): 28-32.

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