pVLT-EGFP载体构建及其在巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）表达研究

doi:10.11924/j.issn.1000-6850.2014-2386

中国农学通报 ›› 2015, Vol. 31 ›› Issue (5): 96-101.doi: 10.11924/j.issn.1000-6850.2014-2386

pVLT-EGFP载体构建及其在巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）表达研究

王继雯

河南省微生物重点实验室，河南省科学院生物研究所有限责任公司

收稿日期:2014-09-01 修回日期:2015-02-05 接受日期:2014-12-03 出版日期:2015-03-20 发布日期:2015-03-20
通讯作者: 王继雯
基金资助:
2013年河南省基础前沿项目“巴西固氮螺菌定殖及其促生长机理研究”(132300413219),2012年河南省重大科技专项“新型复合微生物肥料关键技术研究及产业化”(121100110100)；2013年省级科技基础平台建设专项经费项目“新型农业微生物菌剂的研制及应用”[豫财政(2013)435号]；2014年河南省科学院预研项目“固氮芽孢杆菌的筛选及其竞争适应能力研究”。

Construction of an expression vector pVLT-EGFP can be expressed in Azospirillum brasilense

Received:2014-09-01 Revised:2015-02-05 Accepted:2014-12-03 Online:2015-03-20 Published:2015-03-20

摘要/Abstract

摘要： 为了研究巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）在植物体内的定殖，利用酶切连接的方法，以增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因与表达载体pVLT-33为基本元件，构建了重组表达载体pVLT-EGFP，电转巴西固氮螺菌R7细胞，并利用实时荧光定量PCR (qPCR) 研究了不同温度、不同时间EGFP mRNA的表达情况。酶切及测序结果表明成功构建了pVLT-EGFP载体，并在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达；qPCR结果显示：30 ℃，诱导9 h EGFP基因的表达水平最高。本研究成功构建了重组表达载体pVLT-EGFP，为实现pVLT-EGFP的可控表达及研究固氮菌在植物体内的定殖规律及促生长机理提供了一种有效的途径。

关键词: 滴灌, 滴灌, 干物质积累与分配, 籽粒形成

Abstract: In order to study the colonization of Azospirillum brasilense in plants, an Escherichia coli-A. brasilense shuttle vector pVLT-EGFP can be expressed in A. brasilense was constructed by integrating the enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene of pcDNA3.1-EGFP into the broad host range expression plasmid pVLT-33. The expression vector was transformed into A. brasilense by electroporation methods and the expression of EGFP gene was observed under fluorescent microscope. Using IPTG as an inducing agent, the effect of different time and temperature of IPTG on the expression of pVLT-EGFP was analyzed and the results indicated that the optimal condition for expression was at the temperature of 30℃. The highest expression level of EGFP gene was detected 9 h after inducing. This study enriched A. brasilense genetic transformation system and provided a robust tool to study the colonization of A. brasilense and growth-promoting effect on plants.

王继雯. pVLT-EGFP载体构建及其在巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）表达研究[J]. 中国农学通报, 2015, 31(5): 96-101.

参考文献

[1] 王继雯,谢宝恩,周伏忠,等.高产吲哚乙酸及高泌氨巴西固氮螺菌的筛选与鉴定[J].生物技术,2009(6):14-17.
[2] 张多英,雒江菡,刘红,等.联合固氮的研究进展[J].微生物学杂志,2009(6):55-60.
[3] Guerrero- Molina M F, Winik B C, Pedraza R O, et al. More thanrhizosphere colonization of strawberry plants by Azospirillumbrasilense[J].Applied Soil Ecology,2012,61:205-212.
[4] Rascio N, La Rocca N Encyclopedia of Ecology[M].Oxford:Academic Press,2008:412-419.
[5] Van Dommelen A, Vanderleyden J. Biology of the Nitrogen Cycle.Chapter 12 Associative Nitrogen Fixation[M].Amsterdam: Elsevier,2007:179-192.
[6] 刘华伟,王庆贺,张宏,等.巴西固氮螺菌 Yu62的 EGFP标记及其在小麦体内的定殖研究[J].西北植物学报,2009(12):2367-2372.
[7] He Xiao-chuan CW-l, Huang Qiaoyun. Surface display of monkeymetallothionein α tandem repeatsand EGFP fusion protein onPseudomonas putida X4 for biosorption and detection of cadmium[J].Appl Microbiol Biotechnol,2012,95(6):1605-1613.
[8] Schweizer HP. Vectors to express foreign genes and techniques tomonitor gene expression in Pseudomonads[J].Current Opinion inBiotechnology,2001,12(5):439-445.
[9] Chalfie M(1) T Y, Euskirchen G, Ward W W, et al. Greenfluorescent protein as a marker for gene expression[J].Science,1994,263(5148):802-805.
[10] Heim R CA, Tsien R Y. Improved green fluorescence[J].Nature,1995,373(6516):663-664.
[11] Wang Z, Chen Y, Li S, et al. Successful construction and stableexpression of an anti- CD45RA scFv- EGFP fusion protein inChinese hamster ovary cells[J].Protein Expression and Purification,2014,94:1-6.
[12] 翟中会,陈希南,王娟.利用 PrimerPremier5.0进行引物设计[J].西北医学教育,2008(4):695-698.
[13] 杨键,游志庆,麦志茂,等.大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体的构建及其在蛋白酶基因表达中的应用[J].生物技术通报,2013(9):146-150.
[14] CHI F, SSH, CHEN S F, et al. Migration of Azospirillum brasilenseYu62 from Root to Stem and Leaves Inside Rice and Tobacco Plants[J].Acta Botanica Sinica,2004,46(9):1065-1070.
[15] 栗冬梅,苗志刚,宋秀平,等.巴尔通体液体培养条件简化及生长曲线观察[J].微生物学通报,2012,39(11):1695-1702.
[16] 高颖,褚维伟,张霞,等.猪粪除臭微生物筛选及其生长曲线测定[J].山地农业生物学报,2011(1):47-51.
[17] Knaus H, Blab GA, Jerre van Veluw G, et al. Label- freefluorescence microscopy in fungi[J].Fungal Biology Reviews,2013,27(2):60-66.
[18] Bachem CWB, Hoeven, R.S., Bruijn, S.M. Visualization ofdifferential gene expression using a novel method of RNAfingerprinting based on AFLP: analysis of gene expression duringpotato tuber development[J].Plant J,1996,09(5):745-753.
[19] Gong T, Shu D, Zhao M, et al. Isolation of genes related to abscisicacid production in Botrytis cinerea TB- 3- H8 by cDNA- AFLP[J].Journal of basic microbiology,2014 54(3):204-214.
[20] 王超,孟祥晨.分子信标-实时 PCR法快速检测双歧杆菌的研究[J].微生物学通报,2007,34(6):1163-1166.
[21] 刘亮伟,郭晓丹,王宝.载体大小对木聚糖酶过量表达的影响[J].河南农业大学学报,2010,44(4):448-452.
[22] Jin- Ho. Seo, James E. Bailey. Effects of recombinant plasmidcontent on growth properties and cloned gene product formation inEscherichia coli[J].Biotechnology and Bioengineering,2004,27(12):1668-1674.
[23] DK Summers. The kinetics of plasmid loss[J].Trends inbiotechnology,1991,9(1):273-278.
[24] Bernard R. Glick. Metabolic load and heterologous gene expression[J].Biotechnology Advances,1995,13(2):247-261.
[25] 杨文理,陈守春,陈毅荣.人自剪切 TRAIL胞外段融合蛋白表达条件的优化[J].中国病理生理杂志,2010,26(6):1237-1239.
[26] Xu Yachao, Xue Fushan, Luo Maoping, et al. Median effective doseof remifentanil for awake laryngoscopy and intubation[J].Chin MedJ,2009,122(13):1507-1512.

pVLT-EGFP载体构建及其在巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）表达研究

Construction of an expression vector pVLT-EGFP can be expressed in Azospirillum brasilense

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

参考文献

相关文章 15

编辑推荐

Metrics

本文评价

关于本刊

作者中心

审者中心

在线期刊

联系我们

[1]	罗慧, 李伏生. 番茄滴灌水氮耦合效应与模式研究[J]. 中国农学通报, 2022, 38(3): 30-36.
[2]	黄雅丽, 马风云, 王霞, 郝军, 杜振宇, 刘方春, 石群, 马丙尧. 滴灌水量对核桃幼苗生长的影响[J]. 中国农学通报, 2022, 38(22): 62-68.
[3]	葛选良, 杨恒山, 赵培军, 刘晶, 张雨珊. 浅埋滴灌下分期追氮对玉米花后光合特性、氮素利用和产量的影响[J]. 中国农学通报, 2022, 38(19): 1-7.
[4]	刘建雄, 孙琳琳, 刘珣, 胡华兵, 丁兆斐, 袁团团, 郇町. 水肥一体化条件下不同灌水量对甜菜产质量的影响[J]. 中国农学通报, 2022, 38(19): 12-17.
[5]	郭子赫, 杨恒山, 赵培军, 张玉芹, 刘晶, 包额尔敦, 张瑞富, 李媛媛, 李丹丹, 秦江. 浅埋滴灌条件下灌溉定额对玉米根系形态特征和生理特性的影响[J]. 中国农学通报, 2022, 38(18): 12-19.
[6]	秦文洁, 郭润泽, 邹晓霞, 张晓军, 于晓娜, 王月福, 司彤. 膜下滴灌追肥种类对花生衰老特性和产量的影响[J]. 中国农学通报, 2021, 37(7): 28-36.
[7]	刘大章, 毛丽萍, 李志超, 郑崇兰, 巫玲琳, 祝铭谦, 巫登峰. 水肥一体化滴灌对西昌设施‘克瑞森’无核葡萄果实膨大的影响[J]. 中国农学通报, 2021, 37(35): 34-37.
[8]	钟辉丽, 陆祥生, 刘兴成, 陈天山, 马天伟. 不同土壤改良剂对滴灌模式下次生盐碱化土壤改良效果研究[J]. 中国农学通报, 2021, 37(32): 89-95.
[9]	刘虎, 王健, 阿比亚斯, 陈功, 高天明, 肇志强, 辛海霞. 内蒙古东部膜下滴灌旱作水稻作物需水量与产量研究[J]. 中国农学通报, 2021, 37(29): 146-151.
[10]	王志军, 王碧胜, 孙筱璐, 徐梦杰, 杨晓慧, 侯靳锦, 房全孝. 胶东半湿润区滴灌制度对冬小麦农田土壤水分、作物生长及水分利用的影响[J]. 中国农学通报, 2021, 37(27): 6-15.
[11]	张永强, 张璐, 徐珊, 陈传信, 陈兴武, 雷钧杰, 赛力汗·赛, 薛丽华. 追氮时期及比例对滴灌冬小麦生长特性及产量的影响[J]. 中国农学通报, 2020, 36(25): 1-6.
[12]	胡晓航, 马亚怀, 杨洪泽. 优化滴灌制度下不同品种糖用甜菜产质量及光合特性响应研究[J]. 中国农学通报, 2020, 36(23): 6-18.
[13]	张芸芸, 张利, 董高权, 韩忠玲, 程勇翔, 马淼. 玛纳斯河流域绿洲内部盐渍化土壤年际动态变化[J]. 中国农学通报, 2020, 36(19): 93-103.
[14]	王秋君, 郭德杰, 马艳, 梁永红, 仇美华. 不同化肥减施技术对设施辣椒产量及养分吸收利用的影响[J]. 中国农学通报, 2020, 36(17): 99-107.
[15]	张永强, 张璐, 陈传信, 赛力汗·赛, 薛丽华, 陈兴武, 雷钧杰. 拔节期氮肥运筹对不同滴灌量下冬小麦光合特性及产量的影响[J]. 中国农学通报, 2020, 36(16): 1-6.