甜菜M14品系BvM14-Tpx基因克隆及原核表达体系下应答氧化胁迫功能的初步研究

doi:10.11924/j.issn.1000-6850.casb2020-0147

中国农学通报 ›› 2020, Vol. 36 ›› Issue (32): 30-38.doi: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb2020-0147

所属专题：生物技术；园艺

甜菜M14品系BvM14-Tpx基因克隆及原核表达体系下应答氧化胁迫功能的初步研究

张庭跃¹^,²(), 赵晨曦¹^,², 陈思学¹^,²(), 李洪丽¹^,²()

¹黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心,哈尔滨 150500
²黑龙江大学生命科学学院黑龙江省普通高校分子生物学重点实验室,哈尔滨 150080

收稿日期:2020-06-04 修回日期:2020-08-27 出版日期:2020-11-15 发布日期:2020-11-19
通讯作者: 陈思学,李洪丽
作者简介:张庭跃,男,1997年出生,内蒙古呼伦贝尔人,硕士,研究方向:寒区植物遗传与功能基因组。通信地址:150080 黑龙江省哈尔滨市学府路74号黑龙江大学,E-mail: 985283708@qq.com。
基金资助:
黑龙江省省属高等学校基本科研业务费基础研究项目“甜菜再生体系的建立及优化”(KJCXZD201718);国家自然科学基金面上项目“甜菜M14品系乙二醛酶I基因抗盐能力的转录因子功能研究”(31671751)

Cloning of Thioredoxin Peroxidase Gene in Sugar Beet M14 Line and Its Function Responsive to Oxidative Stress in Prokaryotic Expression System

Zhang Tingyue¹^,²(), Zhao Chenxi¹^,², Chen Sixue¹^,²(), Li Hongli¹^,²()

¹Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology, Ministry of Education, Heilongjiang University, Harbin 150500
²Key Laboratory of Molecular Biology, College of Heilongjiang Province, School of Life Sciences, Heilongjiang University, Harbin 150080

Received:2020-06-04 Revised:2020-08-27 Online:2020-11-15 Published:2020-11-19
Contact: Chen Sixue,Li Hongli

摘要/Abstract

摘要：

为了研究甜菜M14品系BvM14-Tpx基因的抗氧化功能,本试验以带有野生白花甜菜第9号染色体的单体附加系M14品系为试验材料,利用RACE技术获得甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因(BvM14-Tpx) cDNA全长,对其进行生物信息学分析,利用Real-time PCR和半定量RT-PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析,在原核表达体系下进行BvM14-Tpx基因应答氧化胁迫研究。生物信息学分析结果表明,BvM14-Tpx基因cDNA全长为1044 bp,包含最大的ORF为489 bp,编码162个氨基酸;含有过氧化物酶Ⅱ(PrxⅡ)型的保守结构域;BvM14-Tpx蛋白与豌豆(Pisum sativum L.)和苜蓿(Medicago truncatula L.)中Tpx蛋白的亲缘性较高。组织特异性表达分析结果表明,BvM14-Tpx基因在甜菜M14品系各组织表达量从高到低的顺序是根、茎、叶、花。通过原核表达体系下BvM14-Tpx基因应答氧化胁迫的研究,表明BvM14-Tpx基因能够提高大肠杆菌对于环境中氧化胁迫的适应能力,减轻H₂O₂对细菌生长的抑制。本研究对挖掘甜菜M14品系优质基因,提高甜菜对于非生物胁迫的抗性以及开展甜菜遗传改良工作具有重要意义。

关键词: 甜菜M14品系, 硫氧还蛋白过氧化物酶基因, 生物信息学, 原核表达, 氧化胁迫

Abstract:

The purpose is to study the oxidative-resistance function of BvM14-Tpx gene. In this study, the monosomic addition line M14 with the alien No. 9 chromosome from the wild white flower sugar beet species was used as the experimental material. The cDNA full length of thioredoxin peroxidase gene (BvM14-Tpx) in sugar beet M14 line was obtained by RACE technique, and the bioinformatics analysis was carried out. The tissue-specific expression of BvM14-Tpx gene was analyzed by Real-time PCR and semi-quantitative RT-PCR. The BvM14-Tpx gene in response to oxidative stress was studied in prokaryotic expression system. The results of bioinformatics analysis showed that the total cDNA length of BvM14-Tpx gene was 1044 bp including the largest ORF 489 bp, which encoded 162 amino acids and contained the conserved domain of peroxidase Ⅱ (Prx Ⅱ). BvM14-Tpx protein had close genetic relationship with the Tpx protein from Pisum sativum L. and Medicago truncatula L.. The results of tissue specific expression analysis showed that the expression level of BvM14-Tpx gene from high to low was root, stem, leaf and flower. The research on BvM14-Tpx gene in response to oxidative stress in prokaryotic expression system showed that BvM14-Tpx gene could improve the adaptability of Escherichia coli to oxidative stress and reduce the inhibition of H₂O₂ on bacterial growth. This research is of certain significance for mining the high quality genes of sugar beet M14 line, improving the resistance of sugar beet to abiotic stress and carrying out genetic improvement of sugar beet.

Key words: sugar beet M14 line, thioredoxin peroxidase gene, bioinformatics, prokaryotic expression, oxidative stress

中图分类号:

S566.3

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图/表 14

引物功能	引物名称	序列
3′ RACE	M4	5'-GTTTTCCCAGTCACGAaC-3'
3′ RACE	S	5'-CGCATCGTCTACACCCAC-3'
5′ RACE	AS	5'-TGAGCCATTTCGCCTACA-3'
BvM14-Tpx基因cDNA全长的扩增	S1	5'-AATCAGGTGGTGAATTTTCTGTCTC-3'
BvM14-Tpx基因cDNA全长的扩增	AS1	5'-ATTTCGCCTACAATGATTTGCTTTT-3'
内参基因18S rRNA的上游及下游引物	18S-F	5'-CCCCAATGGATCCTCGTTAa-3'
内参基因18S rRNA的上游及下游引物	18S-R	5'-aTGACGGAGAATTAGGGTTCG-3'
BvM14-Tpx基因组织表达分析	S2	5'-AATCGCATCGTCTACACCCACTTTT-3'
BvM14-Tpx基因组织表达分析	AS2	5'-TTTCGCCTACAATGATTTGCTTTTA-3'
原核表达载体构建扩增 BvM14-Tpx基因特异引物	NdeIs	5'- GCGCATATGTCATCACTCATTTTCTCTCTCA -3'
原核表达载体构建扩增 BvM14-Tpx基因特异引物	XhoIas	5'- GCGCTCGAGCAAGGCTTTGAGGATTTC -3'

表1. 试验中所用引物信息

图1. 甜菜M14品系花、叶、茎、根总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳图 1:花;2:叶;3:茎;4:根

图2. BvM14-Tpx 基因3′ RACE扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳图 (a) 图中M:DL2 000 DNA Marker,1:第一轮3′ RACE扩增产物;(b) 图中M:DL2 000 DNA Marker,1:第二轮3′ RACE扩增产物

图3. BvM14-Tpx基因5′RACE扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳图 (a) 图中M:DL2 000 DNA Marker,1:第一轮5′ RACE扩增产物;(b) 图中M:DL2 000 DNA Marker,1:第二轮5′ RACE扩增产物

图4. BvM14-Tpx基因cDNA全长的1%琼脂糖凝胶电泳图 M:DL2 000 DNA Marker;1:BvM14-Tpx基因cDNA全长

图5. BvM14-Tpx基因cDNA全长的开放阅读框分析

序号	开放阅读框分析内容	分析结果	在图5上的标注
1	全长	1044 bp	无
2	最长ORF	489 bp	无
3	编码氨基酸	162个	无
4	理论分子量	17.5 kDa	无
5	等电点	5.49	无
6	起始密码子		黑色方框
7	终止密码子		星号
8	β折叠		橙色双向箭头
9	α螺旋		蓝色横双向箭头
10	糖基化位点		黄色方框
11	蛋白激酶C磷酸化位点		蓝色方框
12	酪蛋白激酶磷酸化位点		紫色方框
13	酰基化位点		粉色方框
14	Tpx过氧化的半胱氨酸		绿色方框
15	Tpx游离的半胱氨酸		红色方框

表2. BvM14-Tpx基因cDNA全长的开放阅读框分析

图6. BvM14-Tpx蛋白多重序列比对橙色横线:α-螺旋;蓝色横线:β-折叠;红色方框:氧化态的半胱氨酸;蓝色方框:还原态的半胱氨酸

图7. BvM14-Tpx蛋白的系统进化树

图8. 利用Real-time PCR分析甜菜M14品系花、叶、茎、根中BvM14-Tpx基因的特异性表达

图9. 利用RT-PCR分析甜菜M14品系花、叶、茎、根中BvM14-Tpx基因的特异性表达 M:DL2 000 DNA Marker;1:花;2:叶;3:茎;4:根

图10. 原核表达载体pET28a-BvM14-Tpx的构建验证 M:DL 2 000 DNA Marker;1:特异引物PCR筛选阳性转化子;2:通用引物PCR筛选阳性转化子

图11. BvM14-Tpx蛋白的原核诱导表达 M:Protein Marker TIANGEN MP102;1~3:0.1 mmol/L IPTG诱导下空载体的菌体总蛋白、上清、沉淀;4~6:0.1 mmol/L IPTG诱导下转化pET28a-BvM14-Tpx的菌体总蛋白、上清、沉淀;7~9:0.5 mmol/L IPTG诱导下转化pET28a-BvM14-Tpx的菌体总蛋白、上清、沉淀;10~12:1.0 mmol/L IPTG诱导下转化pET28a-BvM14-Tpx的菌体总蛋白、上清、沉淀

图12. 大肠杆菌转BvM14-Tpx基因菌株生长曲线的测定

参考文献 28

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甜菜M14品系BvM14-Tpx基因克隆及原核表达体系下应答氧化胁迫功能的初步研究

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