干酪乳杆菌HDS-01甘露聚糖酶基因克隆及生物信息学分析

doi:10.11924/j.issn.1000-6850.casb2023-0165

中国农学通报 ›› 2023, Vol. 39 ›› Issue (26): 33-40.doi: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb2023-0165

干酪乳杆菌HDS-01甘露聚糖酶基因克隆及生物信息学分析

宁莹莹¹(), 张鑫², 赵丹¹()

¹ 黑龙江大学生命科学学院/农业微生物技术教育部工程研究中心/黑龙江省寒区植物基因与生物发酵重点实验室/黑龙江省普通高校微生物重点实验室，哈尔滨 150080
² 长春金赛药业有限责任公司，长春 130012

收稿日期:2023-02-28 修回日期:2023-05-15 出版日期:2023-09-15 发布日期:2023-09-11
通讯作者: 赵丹，女，1980年出生，黑龙江齐齐哈尔人，教授，博士，研究方向：乳酸菌生理及益生特性。通信地址：150080 黑龙江省哈尔滨学府路74号224信箱，Tel：0451-86608661，E-mail：zhaodan4u@163.com。
作者简介:
宁莹莹，女，2000年出生，黑龙江哈尔滨人，硕士，研究方向：乳酸菌生理及益生特性。通信地址：150080 黑龙江省哈尔滨学府路74号224信箱，Tel：0451-86608661，E-mail：ningyingying00@163.com。
基金资助:
国家自然科学基金“干酪乳杆菌-魔芋葡甘聚糖合生元协同效应及其对肠道菌群的调节研究”(32072189); 国家自然科学基金“乙酸溢流与群体感应的协同效应对副干酪乳杆菌HD1.7种群稳定性影响机制的探究”(32071519)

The Cloning and Bioinformatics Analysis of Mannanase Gene in Lactobacillus casei HDS-01

NING Yingying¹(), ZHANG Xin², ZHAO Dan¹()

¹ School of Life Sciences, Heilongjiang University/ Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology, Ministry of Education/ Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Plant Genetic Engineering and Biological Fermentation Engineering for Cold Region/The Key Laboratory of Microbiology in Heilongjiang Provincial Universities, Harbin 150080
² Changchun Kinsey Pharmaceutical Co., Ltd, Changchun 130012

Received:2023-02-28 Revised:2023-05-15 Published-:2023-09-15 Online:2023-09-11

摘要/Abstract

摘要：

本研究旨在借助基因克隆和生物信息学方法挖掘甘露聚糖酶基因的结构和功能。通过本地BLAST比对，从干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) HDS-01的基因组信息中获得甘露聚糖酶基因M1。采用qRT-PCR测定MRS培养基和KGM培养基中M1的差异表达情况，表明KGM培养基中的魔芋粉更好的诱导M1的表达。以L. casei HDS-01基因组DNA为模板克隆基因M1，并利用生物信息学方法对其序列进行预测和分析。该序列长2640 bp，可翻译成879个氨基酸，包括一个2640 bp的开放阅读框；M1蛋白分子量为98723.55 Da，等电点为5.58。这种稳定的M1蛋白的二级结构由α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲组成。研究结果不仅为甘露聚糖酶分子改造提供理论依据，同时有助于了解乳酸菌中甘露聚糖的代谢路径。

关键词: 干酪乳杆菌, 生物信息学, 克隆, 甘露聚糖酶, 蛋白质二级结构

Abstract:

The purpose of this study was to explore the structure and function of mannanase gene by gene cloning and bioinformatics. The mannanase gene M1 was obtained from genome of Lactobacillus casei HDS-01 through local BLAST. The differential expression of M1 in MRS medium and KGM medium was determined by qRT-PCR, indicating that Konjac powder in KGM medium was better in inducing M1 expression. Gene M1 was cloned from genomic DNA of L. casei HDS-01, and its sequence was predicted and analyzed by bioinformatics method. The sequence was 2640 bp and could be translated into 879 amino acids, including a 2640 bp open reading frame. The molecular weight of M1 protein was 98723.55 Da and the isoelectric point was 5.58. The secondary structure of the stable M1 protein consisted of α-helix, β-folding, β-turning and random curling. The results not only provide theoretical basis for the molecular modification of mannanase, but also help to understand the metabolic pathway of mannan in lactic acid bacteria.

Key words: Lactobacillus casei, bioinformatics analysis, clone, mannanase, protein secondary structure

宁莹莹, 张鑫, 赵丹. 干酪乳杆菌HDS-01甘露聚糖酶基因克隆及生物信息学分析[J]. 中国农学通报, 2023, 39(26): 33-40.

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图/表 11

图1. L. casei HDS-01 M1基因和特征性甘露糖苷酶的motif比对

图2. L. casei HDS-01 M1基因在MRS和KGM培养基中的表达情况

图3. L. casei HDS-01在MRS和KGM培养基中的总数动态变化

时间/h	组别	CT值		△CT	△△CT	2^-△△^CT
时间/h	组别	CT-M1	CT-16S	△CT	△△CT	2^-△△^CT
12	MRS	26.07±0.19	26.06±0.25	0.01	0	1.00^a
12	KGM	27.70±0.22	25.46±0.35	2.24	2.23	0.21^b
24	MRS	27.58±0.27	25.15±0.10	2.43	2.42	0.19^b
24	KGM	24.98±0.31	23.31±0.28	1.67	1.67	0.32^b
36	MRS	27.62±0.11	26.69±0.32	0.94	0.93	0.53^b
36	KGM	28.46±0.23	28.85±0.24	-0.39	-0.39	2.49^b
48	MRS	27.75±0.16	27.08±0.14	0.67	0.67	0.63^b
48	KGM	28.58±0.30	27.94±0.26	0.64	0.63	1.63^b
60	MRS	28.52±0.26	28.43±0.21	0.09	0.08	1.03^a
60	KGM	28.17±0.22	28.20±0.33	-0.04	-0.04	1.30^b
72	MRS	28.24±0.18	28.93±0.17	-0.69	-0.70	0.64^b
72	KGM	31.87±0.13	33.19±0.15	-1.33	-1.33	0.95^b

表1. L. casei HDS-01中M1基因的相对表达量

图4. L. casei HDS-01基因组DNA(A)、M1基因PCR结果(B) A：M：DNA Marker DL15000，1：基因组DNA；B：M：DNA Marker DL15000，1：M1基因PCR产物

图5. M13-up和M13-down引物对PCR结果(A)和pT-M1酶切结果(B) A：M：DNA Marker DL15000，8~11：PCR产物；B：M：DNA Marker DL15000，1~2：质粒pT-M1酶切片段

图6. L. casei HDS-01 M1基因ORF分析结果

图7. L. casei HDS-01 M1基因blastn (A)、rpsblast (B)、蛋白重复序列分析结果(C)

图8. L. casei HDS-01 M1蛋白磷酸化位点分析

图9. L. casei HDS-01 M1蛋白疏水性分析结果

图10. L. casei HDS-01 M1蛋白二级结构预测

参考文献 26

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干酪乳杆菌HDS-01甘露聚糖酶基因克隆及生物信息学分析

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