干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)HDS-01甘露聚糖酶基因异源表达及功能验证

doi:10.11924/j.issn.1000-6850.casb2023-0276

中国农学通报 ›› 2023, Vol. 39 ›› Issue (32): 15-21.doi: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb2023-0276

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)HDS-01甘露聚糖酶基因异源表达及功能验证

杨若兮¹(), 张鑫², 赵丹¹^,³()

¹ 黑龙江大学生命科学学院/农业微生物技术教育部工程研究中心/黑龙江省寒区植物基因与生物发酵重点实验室/黑龙江省普通高校微生物重点实验室，哈尔滨 150080
² 长春金赛药业有限责任公司，长春 130012
³ 河北省农业生态安全重点实验室，河北秦皇岛 066102

收稿日期:2023-04-11 修回日期:2023-06-15 出版日期:2023-11-15 发布日期:2023-11-10
通讯作者: 赵丹，女，1980年出生，黑龙江齐齐哈尔人，教授，博士，研究方向：乳酸菌生理及益生特性。通信地址：150080 哈尔滨学府路74号224信箱，Tel：0451-86608661，E-mail：zhaodan4u@163.com。
作者简介:
杨若兮，女，1999年出生，四川乐山人，硕士，研究方向：乳酸菌生理及益生特性。通信地址：150080 哈尔滨学府路74号224信箱，Tel：0451-86608661，E-mail：candelariayang@163.com。
基金资助:
国家自然科学基金“干酪乳杆菌-魔芋葡甘聚糖合生元协同效应及其对肠道菌群的调节研究”(32072189); 国家自然科学基金“乙酸溢流与群体感应的协同效应对副干酪乳杆菌HD1.7种群稳定性影响机制的探究”(32071519)

Mannanase Gene in Lactobacillus casei HDS-01: Heterologous Expression and Functional Verification

YANG Ruoxi¹(), ZHANG Xin², ZHAO Dan¹^,³()

¹ School of Life Sciences, Heilongjiang University/Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology, Ministry of Education/Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Plant Genetic Engineering and Biological Fermentation Engineering for Cold Region/Key Laboratory of Microbiology, College of Heilongjiang, Harbin 150080
² Changchun Kinsey Pharmaceutical Co., Ltd, Changchun 130012
³ Hebei Key Laboratory of Agro-ecological Safety, Qinhuangdao, Hebei 066102

Received:2023-04-11 Revised:2023-06-15 Published-:2023-11-15 Online:2023-11-10

摘要/Abstract

摘要：

为实现甘露聚糖酶基因异源表达并验证功能，本研究以产甘露聚糖酶的副干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) HDS-01为供试菌株，将基因组序列中功能预测为甘露糖苷酶的基因M1在大肠杆菌中表达，分别以pET-28a和Escherichia coli BL21(DE3)为载体和宿主菌构建M1基因工程菌株，纯化重组蛋白并验证甘露聚糖降解功能。结果表明：重组蛋白M1在表达过程中以包涵体形式存在，经Ni柱亲和层析纯化后，SDS-PAGE显示蛋白为98 kDa，复性后酶活和蛋白浓度分别为19.24±0.55 U/mL和0.51±0.01 mg/mL。高效液相色谱(High pressure liquid chromatography, HPLC)检测重组蛋白M1降解魔芋粉的产物，反应前3 h，甘露三糖或四糖浓度显著高，此后，甘露糖和甘露二糖浓度逐渐升高。本研究为产甘露聚糖酶乳酸菌直接用于食品级领域奠定了基础，也为乳酸菌甘露聚糖酶蛋白的定向改造提供了依据。

关键词: β-甘露聚糖酶, 干酪乳杆菌, 异源表达, 重组蛋白, 功能验证

Abstract:

In order to realize heterologous expression of mannanase and verify its functions, the mannanase-producing Lactobacillus casei HDS-01 was used as the test strain in this study. The M1 predicted to be mannosidase was expressed in Escherichia coli. M1 gene engineering strains were constructed using pET-28a as the vector and E. coli BL21 (DE3) as the host. The recombinant protein was purified and the degradation function of mannan was verified. The results indicated that the recombinant protein M1 existed as inclusion body during expression. After purification by Ni affinity chromatography, the size of the protein was 98 kDa. After renaturation, mannanase activity and protein concentration were 19.24±0.55 U/mL and 0.51±0.01 mg/mL, respectively. High pressure liquid chromatography (HPLC) was used to detect the degradation product of Konjac powder. The concentration of mannotriose or tetrasaccharide was significantly higher in the first 3 hours, and mannose and mannobiose gradually increased as the reaction progressing. This study laid the foundation for the direct application of mannanase-producing lactic acid bacteria in food-grade field and provided the basis for the selective modification of mannanase in lactic acid bacteria.

Key words: β-1,4-mannanase, Lactobacillus casei, heterologous expression, recombinant protein, functional verification

杨若兮, 张鑫, 赵丹. 干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)HDS-01甘露聚糖酶基因异源表达及功能验证[J]. 中国农学通报, 2023, 39(32): 15-21.

YANG Ruoxi, ZHANG Xin, ZHAO Dan. Mannanase Gene in Lactobacillus casei HDS-01: Heterologous Expression and Functional Verification[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2023, 39(32): 15-21.

图/表 6

图1. L. casei HDS-01M1基因PCR结果(A)和阳性克隆子质粒PCR验证结果(B) A：M：DNA Marker DL15000，1-2：M1 PCR产物；B：M：DNA Marker DL15000；1：pET28a PCR产物；2：重组质粒pET28a-M1 PCR产物

图2. 重组蛋白SDS-PAGE电泳 A：M：marker；1：E. coli BL21(DE3)菌液；2：重组菌株菌液；3：E. coli BL21(DE3)破壁后上清；4：重组菌株破壁后上清；B：M：Marker；1：E. coli BL21(DE3)菌液；2：重组菌株包涵体溶解离心后上清

图3. SDS-PAGE分析M1蛋白纯化结果(A)和不同浓度咪唑纯化M1重组蛋白(B) A：M：SDS-PAGE蛋白Marker；1：E. coli BL21(DE3)诱导超声后上清；2：重组菌株未诱导超声后混合；3：重组菌株诱导超声后混合；4：重组菌株未诱导超声后上清；5：重组菌株诱导超声后上清；6：重组菌株未诱导超声后沉淀；7：重组菌株诱导超声后沉淀；8：纯化后重组M1；B：M：SDS-PAGE蛋白Marker；1：E. coli BL21(DE3)诱导超声后上清；2：重组菌株诱导超声后混合；3~8：浓度分别为50、80、100、125、150、200 mmol/L的Imidazole的洗脱组分

图4. 基因工程菌株甘露聚糖酶活力测定

图5. 基因工程菌株蛋白浓度测定

图6. 重组蛋白M1水解魔芋粉甘露低聚糖浓度变化

参考文献 27

[1]	NADAROGLU H, DIKBAS N. Purification and Characterization of a β-Mannanase from Lactobacillus plantarum (ATCC 14917TM)[J]. International journal of engine research, 2018, 2(1):1-6. doi: 10.1243/1468087011545316 URL
[2]	陈祺琛, 杨江科, 王兴吉, 等. 耐高温β-甘露聚糖酶基因的高效表达与水解魔芋精粉条件的优化[J]. 食品科技, 2018, 43(8):1-8.
[3]	YANG W. Preparation of konjac oligoglucomannans with different molecular weights and their in vitro and in vivo antioxidant activities[J]. Open life sciences, 2020, 15(1):799-807. doi: 10.1515/biol-2020-0076 URL
[4]	仝泽方, 李利军, 卢美欢, 等. 葡甘聚糖酶制备魔芋葡甘露低聚糖的工艺研究[J]. 中国调味品, 2021, 46(7):167-170.
[5]	ZABIDI N, LING F H, CHWEN L T, et al. Enhancement of versatile extracellular cellulolytic and hemicellulolytic enzyme productions by Lactobacillus plantarum RI 11 isolated from malaysian food using renewable natural polymers[J]. Molecules, 2021, 25(11):150-161. doi: 10.3390/molecules25010150 URL
[6]	NADAROGLU H, ADIGUZEL G, ADIGUZEL A, et al. A thermostable-endo-beta-(1,4)-mannanase from Pediococcus acidilactici (M17): purification, characterization and its application in fruit juice clarification[J]. European food research, 2017, 243(2):193-201. doi: 10.1007/s00217-016-2735-8 URL
[7]	殷运菊, 闫昭明, 陈清华, 等. β-甘露聚糖酶的结构,特性及其在畜禽生产中的应用[J]. 动物营养学报, 2021, 33(5):1-9.
[8]	汤文晶, 李松, 马忠宝, 等. 碱性β-甘露聚糖酶产生菌的筛选,鉴定及发酵条件优化[J]. 食品与发酵工业, 2019, 45(23):50-54.
[9]	郭尚旭, 王瑶, 那金, 等. 细菌β-甘露聚糖酶研究进展[J]. 中国农学通报, 2017, 33(27):61-65. doi: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb17030210
[10]	YANG D, PARK S Y, PARK Y S, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for natural product biosynthesis[J]. Trends in biotechnology, 2020, 38(7): 745-765. doi: 10.1016/j.tibtech.2019.11.007 URL
[11]	LIU Z, NING C, YUAN M, et al. High-efficiency expression of a superior β-mannanase engineered by cooperative substitution method in Pichia pastoris and its application in preparation of prebiotic mannooligosaccharides[J]. Bioresource technology, 2020, 311.
[12]	LIN J, ZOU Y, MA C, et al. Heterologous expression of mannanase and developing a new reporter gene system in Lactobacillus casei and Escherichia coli[J]. Plos one, 2015, 10(11):1-16.
[13]	张丹阳, 吕育财, 田毅红, 等. 枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的克隆表达及重组酶性质研究[J]. 食品工业科技, 2020, 41(6):88-105.
[14]	黄承敏, 肖茜, 王蓉蓉, 等. 一株高产胞外多糖乳酸菌的分离鉴定及其产胞外多糖的研究[J]. 中国酿造, 2019, 38(1):80-83.
[15]	SHIMANE T T, WAJID U M, FENG H, et al. Current trends and potential applications of microbial interactions for human welfare[J]. Frontiers in microbiology, 2018, 9(7):1156. doi: 10.3389/fmicb.2018.01156 URL
[16]	LIU H, LIU J, CUI T. Expression, characterization and structure analysis of a new GH26 endo-β-1,4-mannanase (Man26E) from Enterobacter aerogenes B19[J]. Journal of international environmental application and science, 2020, 19(21):7584-9592.
[17]	季海蕊, 张鑫, 姜静, 等. 乳酸菌β-甘露聚糖酶研究进展[J]. 食品工业科技, 2021, 42(4):325-336.
[18]	杜仁鹏, 赵丹, 王晓宇, 等. 1株乳酸高产菌的分离鉴定与系统发育分析[J]. 中国食品学报, 2017, 17(9):248-255.
[19]	张鑫, 王瑶, 姜静, 等. 干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)HDS-01产甘露聚糖酶条件研究[J]. 中国农学通报, 2020, 36(29):78-86. doi: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb20190900618
[20]	刘学, 卢海强, 王玉印, 等. 甘露聚糖酶AfMan5A和RmMan134C的性质差异分析及对多糖的协同降解[J]. 食品科学, 2022, 43(24):145-153.
[21]	马鑫, 赵仲麟, 李亮, 等. 芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因的克隆及表达[J]. 生物技术通报, 2009(2):77-81.
[22]	朱泾, 赵述淼, 彭楠, 等. 冰岛硫化叶菌β-1,4-内切葡聚糖酶的同源表达、纯化与性质[J]. 华中农业大学学报, 2011, 30(6):674-679.
[23]	董墨思, 解婉莹, 李苏红. 部分酶解瓜尔豆胶功能性的研究进展[J]. 食品工业, 2016, 37(9):212-215.
[24]	ZHANG S B, ZHANG W J, LI N, et al. Functional expression and characterization of an endo-1, 4-β-mannosidase from Triticum aestivum in Pichia pastoris[J]. Biologia, 2020, 74(11):2073-2081.
[25]	者园园, 苗华彪, 吴倩, 等. 耐热β-甘露聚糖酶的异源表达及低聚寡糖制备研究[J]. 饲料研究, 2021(23):63-68.
[26]	甄红敏, 华晓晗, 马俊文, 等. 产黄青霉β-甘露聚糖酶的高效表达、性质及应用[J]. 食品科学, 2021, 42(8):98-105.
[27]	郭金玲, 张丹阳, 樊雪莲, 等. β-甘露聚糖酶产生菌的筛选及魔芋低聚糖制备工艺的研究[J]. 中国酿造, 2018, 37(8):123-127.

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)HDS-01甘露聚糖酶基因异源表达及功能验证

Mannanase Gene in Lactobacillus casei HDS-01: Heterologous Expression and Functional Verification

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[1]	宁莹莹, 张鑫, 赵丹. 干酪乳杆菌HDS-01甘露聚糖酶基因克隆及生物信息学分析[J]. 中国农学通报, 2023, 39(26): 33-40.
[2]	张作达, 吴若娜, 王琴飞, 牛晓磊, 张振文. 植物源功能活性多肽研究进展[J]. 中国农学通报, 2022, 38(12): 88-94.
[3]	潘月, 杨志馨, 杨晓丽, 王旭, 宋刚. 细菌素Paracin 1.7在乳酸乳球菌NZ9000中的异源表达及抑菌性质的研究[J]. 中国农学通报, 2021, 37(26): 15-23.
[4]	姜雪雍, 岳元春, 孙养存, 高冬妮, 平文祥, 葛菁萍. 副干酪乳杆菌与芽孢杆菌属共培养种间关系对产细菌素的影响[J]. 中国农学通报, 2021, 37(24): 124-132.
[5]	杜晓雪, 黄园园, 马春泉, 李海英. 转录因子BvM14-Dof3.4响应盐胁迫的功能研究[J]. 中国农学通报, 2021, 37(21): 119-125.
[6]	张琪, 徐思琪, 赵学通, 盘文政, 尚海丽, 王靓贤, 赵荣彪. 核桃专用溶磷、解钾、促生长高效功能微生物的筛选与复配[J]. 中国农学通报, 2020, 36(34): 64-70.
[7]	张鑫, 王瑶, 姜静, 赵丹. 干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) HDS-01产甘露聚糖酶条件研究[J]. 中国农学通报, 2020, 36(29): 78-86.
[8]	张炎, 房保柱, 平文祥, 葛菁萍. 副干酪乳杆菌HD1.7高密度培养产细菌素Paracin1.7条件优化[J]. 中国农学通报, 2020, 36(24): 116-124.
[9]	刘绍波, 解鑫, 平文祥, 葛菁萍. 控制pH值和溶解氧对地衣芽孢杆菌HDYM-04分批发酵产β-甘露聚糖酶的影响[J]. 中国农学通报, 2020, 36(23): 26-30.
[10]	平文祥,杨睿睿,杜仁鹏,王瑶,王琪,赵丹. 乳酸高产乳酸菌株的分离与筛选[J]. 中国农学通报, 2017, 33(7): 41-47.
[11]	吴迪,穆秋玲,齐晓龙,常迪,李贺娟,郭勇,倪和民. 牛Inhibin pET32a-matpeptide重组蛋白质的诱导表达及鉴定[J]. 中国农学通报, 2017, 33(14): 121-124.
[12]	张倩,张红星,白永强,许宏愿,熊利霞,刘慧. 藏灵菇源干酪乳杆菌发酵剂分批发酵条件的优化[J]. 中国农学通报, 2015, 31(6): 229-233.
[13]	葛菁萍辛星王王莹宋刚平文祥. 三步法分离纯化副干酪乳杆菌细菌素的初步研究[J]. 中国农学通报, 2014, 30(24): 316-320.
[14]	王洋葛菁萍由田平文祥. 副干酪乳杆菌prcA基因克隆及生物信息学分析[J]. 中国农学通报, 2014, 30(18): 259-263.
[15]	李娜李小刚董岩岩张程孙玉科刘钦松. 重组人肿瘤坏死因子TNF-α的克隆与原核表达[J]. 中国农学通报, 2012, 28(9): 180-184.