猪伪狂犬病毒gB蛋白间接化学发光抗体检测方法的建立

doi:10.11924/j.issn.1000-6850.casb2024-0205

中国农学通报 ›› 2024, Vol. 40 ›› Issue (36): 156-164.doi: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb2024-0205

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猪伪狂犬病毒gB蛋白间接化学发光抗体检测方法的建立

向国庆¹^,²(), 宋帅¹, 温肖会¹, 吕殿红¹, 陈玉婷¹, 连聪¹, 贾春玲¹, 顾有方², 罗胜军¹()

¹ 广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广州 510640
² 安徽科技学院动物科学学院/动物营养调控与健康安徽省重点实验室，安徽凤阳 233100

收稿日期:2024-03-28 修回日期:2024-07-29 出版日期:2024-12-25 发布日期:2024-12-23
通讯作者:
罗胜军，男，1974年出生，安徽望江人，副研究员，硕士，主要从事动物疫病防控与监测研究。通信地址：510640 广东省农业科学院动物卫生研究所，E-mail：422368881@qq.com。
作者简介:
向国庆，男，1998年出生，湖南怀化人，硕士，研究方向：动物疫病与防控。通信地址：510640 广东省农业科学院动物卫生研究所，E-mail：1970003770@qq.com。
基金资助:
猪禽种业全国重点实验室开放课题“基于自然语言处理技术的生猪全景组学数智化集成系统开发和应用”(2023QZ-NK14); 广东省科技计划项目“广东省动物疫病野外科学观测研究站项目”(2021B1212050021)

Establishment of an Indirect Chemiluminescent Antibody Detection Method for Porcine Pseudorabies Virus gB Protein

XIANG Guoqing¹^,²(), SONG Shuai¹, WEN Xiaohui¹, LV Dianhong¹, CHEN Yuting¹, LIAN Cong¹, JIA Chunling¹, GU Youfang², LUO Shengjun¹()

¹ Institute of Animal Health, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of Livestock and Poultry Disease Prevention/Guangdong Provincial Scientific Observation and Experiment Station of Veterinary Drugs and Diagnostic Technology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Guangzhou 510640
² Anhui Province Key Laboratory of Animal Nutrition Regulation and Health/ College of Animal Science, Anhui Science and Technology University, Fengyang, Anhui 233100

Received:2024-03-28 Revised:2024-07-29 Published:2024-12-25 Online:2024-12-23

摘要/Abstract

摘要：

研究旨在建立一种快速检测猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)gB蛋白间接CLIA抗体检测方法，以期为猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)的防控和规模化猪群疫苗免疫水平评估提供技术支持。本研究将羧基磁珠与重组gB蛋白进行偶联反应形成免疫磁珠，利用全自动化学发光仪对各项反应条件进行优化；选用6种不同浓度的标准品绘制标准曲线；通过绘制ROC曲线确定阴阳性判定标准；初步完成方法建立后分别对其特异性、敏感度、重复性、符合率进行评估。结果显示磁珠偶联最佳pH 6.0，蛋白偶联最佳浓度为40 μg/mL，10% BSA为最优封闭剂，酶标抗体最佳稀释度为1:20000，血清反应时间为5 min，酶标抗体反应时间为10 min，预激发液反应时间为5 min，最终绘制出一条R²=0.9987的标准曲线，同时将判定标准定为：≥16.78 U为阳性，<16.78 U则为阴性。方法学评估中与7种猪类病原的阳性血清均无交叉反应，敏感度略高于商业化试剂盒，批内批间系数均小于10%，与商业化ELISA试剂盒比对总符合率为98.9%。本研究建立的猪伪狂犬病毒gB蛋白间接化学发光抗体检测方法可用于PR流行病学调查及疫苗免疫水平评估，为后续试剂盒研发提供理论参考。

关键词: 猪伪狂犬病毒, 重组gB蛋白, 化学发光, 抗体, 免疫分析, 标准曲线, ROC曲线

Abstract:

The aim of this study is to establish a rapid indirect CLIA antibody detection method for porcine pseudorabies virus gB protein, in order to provide technical support for the prevention and control of porcine pseudorabies disease and the evaluation of vaccine immunization level in large-scale pig herds. In this study, carboxylated magnetic beads were coupled with recombinant gB protein to form immunomagnetic beads, and the reaction conditions were optimized by using a fully automated chemiluminescence instrument; six different concentrations of standards were used to draw the standard curves; the negative and positive determination criteria were determined by drawing ROC curves; and the specificity, sensitivity, reproducibility, and compliance were evaluated after the preliminary establishment of the method. The results showed that the optimal pH for magnetic bead coupling was 6.0, the optimal concentration for protein coupling was 40 μg/mL, 10% BSA was the optimal sealant, the optimal dilution of enzyme-labeled secondary antibody was 1:20000, the serum reaction time was 5 min, the enzyme-labeled antibody reaction time was 10 min, and the pre-stimulation solution reaction time was 5 min. Finally, a standard curve with R²=0.9987 was drawn, and at the same time the judgment criteria were set as follows: ≥16.78 U was judged as positive, and <16.78 U was judged as negative. In the methodological evaluation, there was no cross-reactivity with the positive sera of 7 porcine pathogens, and the sensitivity was slightly higher than that of the commercial kits, with intra-batch and inter-batch coefficients of less than 10%, and the total compliance rate with the commercial ELISA kits was 98.9%. The indirect chemiluminescent antibody detection method for porcine pseudorabies virus gB protein established in this study can be used for epidemiological investigation of PR and assessment of vaccine immunization level, and provides theoretical reference for the development of subsequent kits.

Key words: porcine pseudorabies virus, recombinant gB protein, chemiluminescence, antibody, immunoassay, standard curve, ROC curve

向国庆, 宋帅, 温肖会, 吕殿红, 陈玉婷, 连聪, 贾春玲, 顾有方, 罗胜军. 猪伪狂犬病毒gB蛋白间接化学发光抗体检测方法的建立[J]. 中国农学通报, 2024, 40(36): 156-164.

XIANG Guoqing, SONG Shuai, WEN Xiaohui, LV Dianhong, CHEN Yuting, LIAN Cong, JIA Chunling, GU Youfang, LUO Shengjun. Establishment of an Indirect Chemiluminescent Antibody Detection Method for Porcine Pseudorabies Virus gB Protein[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2024, 40(36): 156-164.

图/表 15

参考文献 25

[1]	HAHN E C, PAGE G R, HAHN P S, et al. Mechanisms of transmission of Aujeszky's disease virus originating from feral swine in the ΜSA[J]. Veterinary microbiology, 1997, 55(1-4):123-130.
[2]	ZHENG H H, FΜ P F, CHEN H Y, et al. Pseudorabies virus: from pathogenesis to prevention strategies[J]. Viruses, 2022, 14(8):1638-1638.
[3]	陈云蕾, 吴兰, 丁林玲, 等. 猪伪狂犬病检测技术研究进展[J]. 现代畜牧兽医, 2023(7):84-88.
[4]	BO Z Y, LI X D. A review of pseudorabies virus variants: genomics, vaccination, transmission, and zoonotic potential[J]. Viruses, 2022, 14(5):1003.
[5]	潘姣姣, 王同燕, 郭玲花, 等. 猪伪狂犬病病毒gB、gC和gD蛋白的表达及诊断抗原筛选[J]. 动物医学进展, 2023, 44(4):12-19.
[6]	贾刚, 樊梅娜, 谷巍. 猪伪狂犬病病毒gB蛋白表达及免疫原性分析[J]. 中国畜牧兽医, 2017, 44(4):1175-1181. doi: 10.16431/j.cnki.1671-7236.2017.04.033
[7]	WU X, CHEN R, CHEN Q, et al. Establishment of an indirect ELISA method for antibody detection of porcine pseudorabies by recombinant gB, gC, and gD proteins[J]. Journal of medical virology, 2023, 95(1):e28228.
[8]	刘旻翾, 丁光明, 付钰广, 等. 猪伪狂犬病毒间接ELISA抗体检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报, 2019, 41(5):484-488.
[9]	YANG Y, LV C, FAN J, et al. Development of a chemiluminescence immunoassay to accurately detect African swine fever virus antibodies in serum[J]. Journal of virological methods, 2021,298:114269.
[10]	魏宏, 陈秋勇, 吴学敏, 等. 化学发光免疫分析技术在疾病研究中的应用[J]. 福建畜牧兽医, 2020, 42(6):27-30.
[11]	李世新. 猪伪狂犬病的诊断与防治[J]. 中国动物保健, 2023, 25(2):26-27.
[12]	冯兴赛, 张馨丹. 猪伪狂犬病的诊断与防治措施[J]. 吉林畜牧兽医, 2023, 44(12):49-50.
[13]	刘运超, 杨素珍, 尚延丽, 等. 伪狂犬病病毒研究进展[J]. 畜牧与兽医, 2024, 56(2):124-130.
[14]	POMERANZ L E, REYNOLDS A E, HENGARTNER C J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine[J]. Microbiology and molecular biology reviews, 2005, 69(3):462-500. doi: 10.1128/MMBR.69.3.462-500.2005 pmid: 16148307
[15]	王秀丽, 薄智勇, 王艳凤, 等. 猪伪狂犬病毒特点及分离鉴定[J]. 中国动物保健, 2024, 26(1):22-23.
[16]	罗飞, 陈义平, 陆明哲, 等. 猪伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gB主要抗原表位区基因的克隆及原核表达[J]. 中国动物检疫, 2009, 26(12):27-28.
[17]	吴学敏, 陈如敬, 陈秋勇, 等. 新型伪狂犬病病毒gB、gC蛋白串联表达及免疫活性分析[J]. 中国动物传染病学报, 2022, 30(5):60-65.
[18]	万曾培, 王征帆, 庞旋飞, 等. PRV变异株gB和gC基因分子特征及抗原差异性分析[J]. 中国兽医学报, 2020, 40(8):1454-1460.
[19]	ALI A, SHAH T, ΜLLAH R, et al. Review on recent progress in magnetic nanoparticles: synthesis, characterization, and diverse applications[J]. Frontiers in chemistry, 2021,9:629054.
[20]	向国庆, 连聪, 孙栋, 等. 化学发光免疫分析法及在动物生产领域检测中的应用进展[J]. 中国兽医科学, 2023, 53(10):1320-1325.
[21]	封莹洁, 张同锋, 罗娟, 等. 化学发光免疫分析法简介及其在动物疫病检测中的研究进展[J]. 中国动物检疫, 2023, 40(12):73-79.
[22]	折尕才措. 猪伪狂犬病病毒间接ELISA检测方法的建立[J]. 动物医学进展, 2012, 33(9):128-132.
[23]	王方, 张泽财, 袁悦, 等. 伪狂犬病病毒gB蛋白单抗的制备及其夹心ELISA检测方法的建立[J]. 中国兽医学报, 2020, 40(2):225-230.
[24]	张苗苗, 唐桂佳. 伪狂犬病毒(PRV)间接ELISA试验[J]. 中国畜禽种业, 2016, 12(1):70-71.
[25]	罗飞, 李宇琴, 陈义平, 等. 猪伪狂犬病血清抗体gB-ELISA检测方法的建立[J]. 中国兽药杂志, 2011, 45(7):10-13.

pH	阳性样品发光值P(RLU)	阴性样品发光值N(RLU)	P/N
5.0	2684533	58469	45.9
6.0	3157258	67345	46.9
7.0	1807813	68237	26.5
8.0	1484844	69928	21.2
9.0	1560101	68543	22.8

pH	阳性样品发光值P(RLU)	阴性样品发光值N(RLU)	P/N
5.0	2684533	58469	45.9
6.0	3157258	67345	46.9
7.0	1807813	68237	26.5
8.0	1484844	69928	21.2
9.0	1560101	68543	22.8

蛋白浓度/(μg/mL)	阳性样品发光值P(RLU)	阴性样品发光值N(RLU)	P/N
10	2102131	39788	52.8
20	1632437	41895	39.0
30	1658782	39862	41.6
40	3472873	37781	91.9
50	1461564	47973	30.5

蛋白浓度/(μg/mL)	阳性样品发光值P(RLU)	阴性样品发光值N(RLU)	P/N
10	2102131	39788	52.8
20	1632437	41895	39.0
30	1658782	39862	41.6
40	3472873	37781	91.9
50	1461564	47973	30.5

封闭剂	阳性样品发光值P(RLU)	阴性样品发光值N(RLU)	P/N
3%海藻糖	793845	36087	22.0
1% PBST	1064778	45529	23.4
1%明胶	145741	28900	5.0
5%脱脂奶粉	1403831	40153	35.0
10% BSA	3250976	71952	45.2

猪伪狂犬病毒gB蛋白间接化学发光抗体检测方法的建立

Establishment of an Indirect Chemiluminescent Antibody Detection Method for Porcine Pseudorabies Virus gB Protein

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样品量/μL	阳性样品发光值P(RLU)	阴性样品发光值N(RLU)	P/N
5	3889908	86517	45.0
10	5065746	103877	48.8
15	5023963	106658	47.1
20	4771673	118178	40.4
25	4394243	122397	35.9

稀释浓度	阳性样品发光值P(RLU)	阴性样品发光值N(RLU)	P/N
1:10000	6868900	329418	20.9
1:20000	4734623	112942	41.9
1:30000	4583142	122874	37.3
1:40000	3494908	126010	27.7
1:50000	2884749	116010	24.9

免疫时间/min	阳性样品发光值P(RLU)	阴性样品发光值N(RLU)	P/N
1	3857419	79019	48.8
5	4530710	86522	52.4
10	4760014	102876	46.3
15	4800653	110501	43.4
20	5162851	113251	45.6

免疫时间/min	阳性样品发光值P(RLU)	阴性样品发光值N(RLU)	P/N
1	764090	41576	18.4
5	2707292	101743	26.6
10	4961879	110601	44.9
15	5138099	117564	43.7
20	5133389	114348	44.9

反应时间/min	阳性样品发光值P(RLU)	阴性样品发光值N(RLU)	P/N
1	3960909	112480	35.2
3	3783333	110852	34.1
5	3669905	100465	36.5
7	3288405	116636	28.2
9	2911453	123809	23.5

检测项目	化学发光值(RLU)	浓度值/U	结果判定
CSFV	233612	13.86	阴性
JEV	175619	7.16	阴性
PRRSV	130945	3.43	阴性
PCV2	217468	11.99	阴性
PRV-gE	218259	12.08	阴性
FMDV-O	80130	0	阴性
HPs	199766	9.95	阴性
PRV-gB	2021576	578.64	阳性

稀释倍数	CLIA						ELISA
稀释倍数	发光值(RLU)		浓度/U		结果判定		OD值	S/P	结果判定
1:2	3673034		1505.61		阳性		2.655	5.94	阳性
1:4	2609158		839.91		阳性		2.203	4.9	阳性
1:8	1687701		452.78		阳性		1.653	3.63	阳性
1:16	1014210		224.21		阳性		1.12	2.4	阳性
1:32	683536		127.1		阳性		0.654	1.32	阳性
1:64	440474		57.09		阳性		0.42	0.78	阳性
1:128		290361		20.43		阳性		0.269	0.43	阴性
1:256	209450		11.06		阴性		0.199	0.27	阴性
1:512	141699		4.26		阴性		0.145	0.14	阴性
1:1024	92165		0.46		阴性		0.115	0.08	阴性
1:2048	74505		0		阴性		0.095	0.03	阴性
1:4096	62283		0		阴性		0.085	0.01	阴性

浓度值/U	血清样品编号
浓度值/U	1	2	3
1	1239.66	270.19	24.63
2	1169.30	260.41	28.64
3	1037.75	215.49	23.72
4	1112.96	217.61	25.02
5	1073.4	232.3	28.77
6	1242.8	246.58	34.63
平均值	1145.98	240.43	25.57
标准差	85.75	22.5	1.81
变异系数(CV)/%	7.48	9.36	7.07

样品编号	不同批次磁珠						平均值	标准差	变异系数(CV)/%
样品编号	1		2		3		平均值	标准差	变异系数(CV)/%
1	875.46	923.12	1162.73	1053.41	1005.23	984.31	995.83	78.28	7.86
1	935.05	950.83	1083.12	972.56	968.23	1035.93	995.83	78.28	7.86
2	351.06	380.82	387.24	371.81	367.12	407.92	377.97	19.15	5.06
2	387.84	340.4	380.08	386.86	373.19	401.41	377.97	19.15	5.06
3	27.73	29.83	32.42	32.79	26.56	25.28	29.02	2.71	9.34

方法	间接CLIA
方法	项目	阳性	阴性	合计
ELISA	阳性	88	1	89
	阴性	0	3	3
	合计	88	4	92

[1]	王东萍, 于可响, 韩青海, 刘振林, 常海霞, 吴蕾, 刘杰, 李倩, 吴俊, 崔雪志. 雏鸭母源抗体对新型鸭呼肠孤病毒保护效果研究[J]. 中国农学通报, 2024, 40(26): 120-125.
[2]	郭思依, 孙明娜, 董旭, 褚玥, 童舟, 王梅, 高同春, 段劲生. 免疫分析技术在农药残留快速检测中的应用及研究进展[J]. 中国农学通报, 2021, 37(23): 106-112.
[3]	韩涛涛, 黎露, 唐青海, 吴广艳, 孙国印, 李晓楠, 常秋玲, 杨海, 唐斯萍, 王芳宇. 不同佐剂对猪传染性胃肠炎病毒S蛋白和猪流行性腹泻病毒S蛋白免疫原性的影响[J]. 中国农学通报, 2020, 36(30): 143-140.
[4]	魏博帆,王景娅,孙妍妍,王露,李晓哲,邱礽,乔惠丽. 家蚕化学感受蛋白CSP9的抗体制备及表达分析[J]. 中国农学通报, 2019, 35(34): 44-49.
[5]	李晓白,任晓明,王斌,姚学军,朱伯阳,李晓璐,刘志忠,邢国栋,纪晨晨,薛勇,李腾,王天坤,孙宝山. 羊接种布鲁氏菌S2菌苗抗体消长规律研究[J]. 中国农学通报, 2018, 34(9): 119-123.
[6]	焦秋伟,孙欢欢,孟利. 阪崎肠杆菌多克隆抗体的制备与鉴定[J]. 中国农学通报, 2018, 34(30): 123-128.
[7]	余厚美,安飞飞,罗秀芹,陈松笔,欧文军. 淀粉磷酸化酶原核表达及单克隆抗体的制备[J]. 中国农学通报, 2017, 33(14): 28-32.
[8]	刘秦燕,李伟,阳仲斌,金晨钟,张雪娇,胡军和. 一种20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂的液相色谱检测方法的研究[J]. 中国农学通报, 2015, 31(31): 213-216.
[9]	王爱萍,裴艳艳,周景明,李鹏飞,赵金梦,陈菲,车志芬,祁艳华. 伊维菌素人工抗原的制备及鉴定[J]. 中国农学通报, 2015, 31(17): 22-27.
[10]	刘新月,王黎霞,宋丽聪,赵晨璐,张建军,安健. 鸡柔嫩艾美耳球虫特异性抗体EtMIC4-N蛋白BAS-ELISA检测方法的建立[J]. 中国农学通报, 2015, 31(14): 44-50.
[11]	朱赫纪明山. 农药残留快速检测技术的最新进展[J]. 中国农学通报, 2014, 30(4): 242-250.
[12]	郑胜兰. 南方水稻黑条矮缩病毒P6抗体的制备及应用[J]. 中国农学通报, 2014, 30(28): 270-274.
[13]	孟凡伟王俊单晶晶周双海李雅慧高晓波. 猪圆环病毒II型ORF4真核表达载体构建及其抗体制备[J]. 中国农学通报, 2014, 30(2): 60-64.
[14]	邓培渊李玉华袁丹丹王国霞李长看. 家蚕化学感受蛋白BmCSP8表达谱及多克隆抗体制备[J]. 中国农学通报, 2014, 30(19): 298-303.
[15]	王爱萍栗宁祁艳华段倩倩郑伟王新洲裴艳艳周景明. 卡那霉素人工抗原的制备及鉴定[J]. 中国农学通报, 2014, 30(17): 26-30.