苹果SSR-PCR反应体系的建立与优化

doi:10.11924/j.issn.1000-6850.casb20200100068

中国农学通报 ›› 2021, Vol. 37 ›› Issue (1): 61-66.doi: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb20200100068

所属专题：园艺

苹果SSR-PCR反应体系的建立与优化

刘琳¹(), 孙晓帅², 李乾¹, 范书臣¹, 时鸿迪¹, 马钧³, 刘丹丹¹()

¹云南大学农学院,昆明 650091
²西藏大学理学院,拉萨 850000
³云南省农业科学院园艺作物所,昆明 650091

收稿日期:2020-01-20 修回日期:2020-03-24 出版日期:2021-01-05 发布日期:2020-12-25
通讯作者: 刘丹丹
作者简介:刘琳,女,1994年出生,陕西铜川人,硕士,研究方向为果树种质资源。通信地址：650091 云南省昆明市呈贡区云南大学呈贡校区农学院,Tel：0871-65031539,E-mail：xuecangll@163.com。
基金资助:
云南省科技计划“云南特色水果品质提升与优势品牌创建”(2019ZG002);国家自然科学基金“苹果砧木平邑甜茶PcG蛋白MhMSI1调控单性生殖的分子机理”(31660566)

Establishment and Optimization of SSR-PCR Reaction System of Apple Plants

Liu Lin¹(), Sun Xiaoshuai², Li Qian¹, Fan Shuchen¹, Shi Hongdi¹, Ma Jun³, Liu Dandan¹()

¹College of Agriculture, Yunnan University, Kunming 650091
²College of Science, Tibet University, Lhasa 850000
³Institute of Horticultural Crops, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650091

Received:2020-01-20 Revised:2020-03-24 Online:2021-01-05 Published:2020-12-25
Contact: Liu Dandan

摘要/Abstract

摘要：

为建立苹果属植物SSR-PCR反应优化体系,采用L₁₆(4⁵)正交实验和退火温度梯度实验,分析反应体系中使用的模板、引物、Mg²⁺、dNTPs以及Top Taq酶浓度对扩增产物的影响,并对这5个因素进行4个水平不同浓度梯度的筛选和优化。结果表明,引物浓度对SSR-PCR反应体系的影响最大,通过综合分析最终确定SSR-PCR的25 μL最佳反应体系为：30~60 ng DNA模板,1.2 μL正反向引物(5 μmol/L),0.5 μL dNTPs(2.5 mmol/L),0.5 μL Top Taq酶(2.5 U/μL)以及2.5 μL 10× Top Taq buffer（含Mg²⁺）。利用优化后的反应体系对蔷薇科苹果属的21种植物材料进行检测,实验结果表明扩增产物均在100~200 bp左右,可扩增出2~3个有效等位基因。通过优化反应体系中的各影响因素,建立了最佳的SSR-PCR反应体系,可为苹果属植物不同种群的遗传变异研究及亲缘关系的分子鉴定提供前期研究基础。

关键词: 苹果, SSR-PCR最佳反应体系, 正交设计试验, 种质资源, 单因素试验

Abstract:

To establish an optimal SSR-PCR system for apple plants, the L₁₆(4⁵) orthogonal test and the annealing temperature gradient experiment were used to analyze the effect of template concentration, primer concentration, Mg²⁺concentration, dNTPs concentration and Top Taq enzyme concentration in the SSR reaction system on the amplification products. Additionally, the above five factors were screened and optimized at 4 different levels. The results showed that the primer concentration factor had the greatest impact on the SSR-PCR reaction system. Though analysis, the optimal reaction system of 25 μL for SSR-PCR was finally determined to be as follows: 30-60 ng DNA template, 1.2 μL forward and reverse primer (5 μmol/L), 0.5 μL dNTPs (2.5 mmol/L), 0.5 μL Top Taq enzyme (2.5 U/μL) and 2.5 μL 10×Top Taq buffer (containing Mg²⁺). Finally, optimized reaction system was used for PCR amplification using 21 different apple plants, and the amplification products were about 100-200 bp displaying 2-3 alleles. The optimal SSR-PCR reaction system can provide a preliminary basis for the genetic variation research and molecular identification of genetic relationships in different populations of apple plants.

Key words: apple, SSR-PCR optimal reaction system, orthogonal design experiment, germplasm resource, single factor test

中图分类号:

S661.1

刘琳, 孙晓帅, 李乾, 范书臣, 时鸿迪, 马钧, 刘丹丹. 苹果SSR-PCR反应体系的建立与优化[J]. 中国农学通报, 2021, 37(1): 61-66.

Liu Lin, Sun Xiaoshuai, Li Qian, Fan Shuchen, Shi Hongdi, Ma Jun, Liu Dandan. Establishment and Optimization of SSR-PCR Reaction System of Apple Plants[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2021, 37(1): 61-66.

图/表 10

参考文献 28

[1]	毛翔. 基于价值链的苹果关键生产技术研究[D]. 泰安:山东农业大学, 2013.
[2]	张聪颖, 畅倩, 霍学喜. 中国苹果生产区域变迁分析[J]. 经济地理, 2018(8):141-151.
[3]	陈亚东. 我国苹果产业数据资源建设与整合研究[D]. 北京:中国农业科学院, 2016.
[4]	马遇伯, 李全新. 中国苹果产业发展现状与前景——以陕西省白水县为例[J]. 农业展望, 2019,15(4):38-42.
[5]	徐明举. 苹果高纺锤形栽培新模式技术应用[J]. 果农之友, 2014(10):11-12.
[6]	杜学梅, 杨廷桢, 高敬东, 等. 苹果矮砧育种国内研究进展[J]. 中国农学通报, 2017,33(19):57-64.
[7]	钱关泽, 汤庚国. 苹果属植物分类学研究进展[J]. 南京林业大学学报:自然科学版, 2005,29(3):94-98.
[8]	钱关泽. 苹果属(Malus Mill.)分类学研究[D]. 南京:南京林业大学, 2005.
[9]	王昆, 刘凤之, 高源, 等. 我国苹果种质资源基础研究进展[J]. 中国果树, 2013,31(2):66-69.
[10]	白玉. DNA分子标记技术及其应用[J]. 安徽农业科学, 2007,35(24):7422-7424.
[11]	刘丽丽, 李建辉, 郑雪良, 等. DNA分子标记技术在桃研究中的应用[J]. 农业科技通讯, 2017(1):25-28.
[12]	Agarwal M, Shribastava N, Padh H. Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences[J]. Plant Cell Reports, 2008,27:617-631.
[13]	何琳, 王群. 基于PCR的SSR标记分离方法综述[J]. 基因组学与应用生物学, 2010,29(4):173-180.
[14]	Gianfranceschi L, Seglias N, Tarchini R, et al. Simple sequence repeats for the genetic analysis of apple[J]. Theoretical Apple Genetics, 1998,96:1069-1076.
[15]	Silferberg-Dilworth E, Matasci C L, Van D E, et al. Microsatellite markers spanning the apple (Malus domestica Borkh.) genome[J]. Tree Genetics Genomes, 2006,2:202-224.
[16]	Patocchi A, Walser M, Tartarini S, et al. Identification by genome scanning approach (GSA) of a microsatellite tightly associated with the apple scab resistance gene Vm[J]. Genome, 2005,48(4):630-636. doi: 10.1139/g05-036 URL pmid: 16094431
[17]	Weg W E V D, Voorrops R E, Finker R, et al. Pedigree genotyping: A new pedigree-based approach of QTL identification and allele mining[J]. Acta Horticulturae, 2003,663.
[18]	Liebhard R, Gianfranceschi L, Koller B, et al. Development and microsatellite markers characterization of 140 new microsatellites in apple (Malus domestica Borkh.)[J]. Molecular Breeding, 2002,10:217-241.
[19]	何正文, 刘运生, 陈立华, 等. 正交设计直观分析法优化PCR条件[J]. 湖南医科大学学报, 1998,23(4):403-404.
[20]	高兵, 安文杰, 孙俊. 苹果愈伤组织SSR-PCR反应体系优化[J]. 北方园艺, 2018(10):53-56.
[21]	刘晓丽, 何天明, 张美勇, 等. 核桃SSR反应体系的优化[J]. 果树学报, 2007,24(2):140-145.
[22]	代红艳, 张志宏, 周传生, 等. 山楂ISSR分析体系的建立和优化[J]. 果树学报, 2007,24(3):313-318.
[23]	刘玲, 陈祥平, 范小敏, 等. 桑树SSR-PCR反应体系的优化[J]. 江苏农业科学, 2019,47(14):45-49,58.
[24]	柴华, 孙静, 曹立军, 等. 正交设计优化青贮玉米自交系ISSR-PCR反应体系[J]. 种子, 2015,34(9):102-105.
[25]	杨水云, 李续娥, 吴明宇, 等. 正交实验法在PCR反应条件优化中的应用[J]. 生物数学学报, 2005,20(2):202-206.
[26]	蔡胜文, 孙浩元, 杨丽, 等. 仁用杏远缘杂交后代SSR-PCR反应体系的优化[J]. 中国农学通报, 2008,24(7):50-54.
[27]	艾鹏飞, 方闪闪, 甄志军, 等. 仁用杏SSR反应体系的建立与优化[J]. 北方园艺, 2009,3(8):68-70.
[28]	杨绍林, 王先宏, 李苏洁, 等. 应用降落PCR和正交设计优化甘蔗“割手密”SSR-PCR反应体系[J]. 分子植物育种, 2016,14(2):431-436.

编号	品种	编号	品种	编号	品种
1	德国红星	8	金帅	15	北斗
2	华艳	9	美国8号	16	新红王将
3	金世纪	10	中秋王	17	红蛇
4	红元帅	11	密脆	18	国光
5	乔纳金	12	假红肉	19	华美
6	中原	13	华丹	20	皮诺娃
7	烟富3	14	七月红	21	粉红女士

编号	品种	编号	品种	编号	品种
1	德国红星	8	金帅	15	北斗
2	华艳	9	美国8号	16	新红王将
3	金世纪	10	中秋王	17	红蛇
4	红元帅	11	密脆	18	国光
5	乔纳金	12	假红肉	19	华美
6	中原	13	华丹	20	皮诺娃
7	烟富3	14	七月红	21	粉红女士

引物名称	F(5’-3’)	R(3’-5’)
CH03d11	ACCCCACAGAAACCTTCTCC	CAACTGCAAGAATCGCAGAG
CH01h02¹	AGAGCTTCGAGCTTCGTTTG	ATCTTTTGGTGCTCCCACAC

引物名称	F(5’-3’)	R(3’-5’)
CH03d11	ACCCCACAGAAACCTTCTCC	CAACTGCAAGAATCGCAGAG
CH01h02¹	AGAGCTTCGAGCTTCGTTTG	ATCTTTTGGTGCTCCCACAC

水平	因素
水平	模板DNA浓度/(ng/μL)	引物浓度/(μmol/μL)	Top Taq buffer(Mg²⁺)/(μmol/μL)	dNTPs/(μmol/μL)	Top Taq/(U/μL)
1	2.25	1.50	2.25	2.50	2.50
2	2.25	3.00	3.00	2.50	2.50
3	2.50	2.75	2.50	2.25	2.25
4	3.00	3.00	2.25	2.50	2.00

苹果SSR-PCR反应体系的建立与优化

Establishment and Optimization of SSR-PCR Reaction System of Apple Plants

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组合编号	模板DNA浓度/(ng/μL)	引物浓度/(μmol/μL)	Top Taq buffer(Mg²⁺)/(μmol/μL)	dNTPs/(μmol/μL)	Top Taq/(U/μL)
1	1.2	0.1	1	0.05	0.25
2	1.2	0.2	2	0.10	0.50
3	1.2	0.3	3	0.15	0.75
4	1.2	0.4	4	0.20	1.00
5	1.6	0.1	1	0.05	0.25
6	1.6	0.2	2	0.10	0.50
7	1.6	0.3	3	0.15	0.75
8	1.6	0.4	4	0.20	1.00
9	2.0	0.1	1	0.05	0.25
10	2.0	0.2	2	0.10	0.50
11	2.0	0.3	3	0.15	0.75
12	2.0	0.4	4	0.20	1.00
13	2.4	0.1	1	0.05	0.25
14	2.4	0.2	2	0.10	0.50
15	2.4	0.3	3	0.15	0.75
16	2.4	0.4	4	0.20	1.00

编号	品种	浓度/(ng/μL)	OD₂₆₀/OD₂₈₀
1	德国红星	966.10	1.93
2	华艳	619.60	1.89
3	金世纪	1124.3	2.00
4	红元帅	494.90	2.05
5	乔纳金	1170.3	2,01
6	中原	104.90	1.90
7	烟富3	721.70	1.94
8	金帅	1809.1	1.82
9	美国8号	530.60	2.01
10	中秋王	2853.7	2.07
11	密脆	518.40	1.96
12	假红肉	835.80	1.81
13	华丹	446.40	2.00
14	七月红	974.00	2.02
15	北斗	260.40	2.10
16	新红王将	650.20	1.85
17	红蛇	466.50	1.91
18	国光	275.90	1.91
19	华美	547.30	1.89
20	皮诺娃	496.50	1.96
21	粉红女士	817.20	1.93

项目	扩增条带数
项目	模板DNA浓度	引物浓度	Top Taq buffer(Mg²⁺)	dNTPs	Top Taq
K₁	2.25	1.50	2.25	2.50	2.50
K₂	2.25	3.00	3.00	2.50	2.50
K₃	2.50	2.75	2.50	2.25	2.25
K₄	3.00	3.00	2.25	2.50	2.00
R	0.75	1.50	0.75	0.25	0.50

[1]	纪坤, 王彬, 赵博文, 薛浩, 吴建民, 朱晓建, 王依欣, 赵海军, 韩赞平. 不同玉米种质材料植株与穗粒性状的灰色关联度分析[J]. 中国农学通报, 2022, 38(9): 27-32.
[2]	王彦, 朱凯迪, 孙洪仁, 张吉萍, 吕玉才, 王剑. 中国苹果土壤养分丰缺指标与适宜施肥量初步研究[J]. 中国农学通报, 2022, 38(5): 69-78.
[3]	刘翠兰, 王开芳, 吴德军, 燕丽萍, 李善文, 王芳, 任飞, 王因花. 滨海盐碱胁迫下白蜡无性系生长及生理特性的响应[J]. 中国农学通报, 2022, 38(35): 7-16.
[4]	陈慧玲, 张新叶, 彭婵, 刘宗坤, 庞宏东, 刘炼, 杨彦伶. 13个药用石斛种质生物学特性比较研究[J]. 中国农学通报, 2022, 38(3): 94-101.
[5]	邵荣峰, 张伟, 张阳, 王官, 常玉卉, 白文斌, 赵威军. 秋水仙素诱导甜高粱‘FH59’种子变异效应研究[J]. 中国农学通报, 2022, 38(27): 1-5.
[6]	姚肖健, 张雄坚, 姚祝芳, 罗忠霞, 王章英, 黄立飞, 房伯平, 杨义伶. 甘薯种质资源盆栽保存基质的筛选与评价[J]. 中国农学通报, 2022, 38(24): 28-37.
[7]	姚志龙, 韩萍, 王军锋, 王嘉倩. 庆阳苹果树需水规律分析[J]. 中国农学通报, 2022, 38(23): 27-31.
[8]	段永红, 余亚莹, 唐潇, 邓晶. 地方农作物种质资源库建设的建议与思考[J]. 中国农学通报, 2022, 38(22): 139-144.
[9]	乔绪强, 郭婷婷, 杨炳松, 李建召, 梁美霞. 苹果组培苗移栽过程中根茎叶解剖结构变化[J]. 中国农学通报, 2022, 38(22): 49-54.
[10]	张勇, 屈振江, 刘跃峰, 刘璐, 李艳莉, 潘宇鹰. 气候变化对不同产区苹果安全越冬的可能影响[J]. 中国农学通报, 2022, 38(21): 88-96.
[11]	白宇轩, 杜军, 王挺, 索朗旺堆. 2001—2020年藏东南苹果物候期变化特征分析[J]. 中国农学通报, 2022, 38(20): 89-96.
[12]	王丽, 侯珲, 黄天祥, 袁洪波, 涂洪涛. 苹果生产中杀菌剂使用控制技术调查及分析[J]. 中国农学通报, 2022, 38(18): 147-152.
[13]	李俊萍, 王秀萍, 刘素娟, 鲁雪林, 吴哲. 玉米苗期耐盐性鉴定评价方法研究[J]. 中国农学通报, 2022, 38(18): 28-34.
[14]	张永超, 解德宏, 张翠仙, 陈于福, 柏天琦, 易怀锋, 尼章光, 章勇, 王美存. 红河流域杧果种质资源主要数量性状变异与概率分级[J]. 中国农学通报, 2022, 38(16): 68-73.
[15]	李文业, 徐放, 王海华, 朱报著. ‘广东含笑’研究进展[J]. 中国农学通报, 2022, 38(14): 47-52.