黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌的实时荧光定量PCR检测方法建立

doi:10.11924/j.issn.1000-6850.casb2023-0496

中国农学通报 ›› 2024, Vol. 40 ›› Issue (15): 110-116.doi: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb2023-0496

黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌的实时荧光定量PCR检测方法建立

徐英芝¹(), 赵丽梅¹, 祖未希², 高芬³()

¹ 山西大学中医药现代研究中心，太原 030006
² 太原旅游职业学院酒店管理系，太原 030032
³ 山西大学应用化学研究所，太原 030006

收稿日期:2023-07-07 修回日期:2023-10-16 出版日期:2024-05-23 发布日期:2024-05-23
通讯作者:
高芬，女，1969年出生，山西寿阳人，副教授，博士，研究方向：药用植物病害及其生物防治。通信地址：030006 山西省太原市小店区坞城路92号山西大学应用化学研究所，E-mail：gaofen@sxu.edu.cn。
作者简介:
徐英芝，女，1999年出生，湖南长沙人，硕士研究生，研究方向：药用植物与病原真菌的互作机制。通信地址：030006 山西省太原市小店区坞城路92号山西大学中医药现代研究中心，E-mail：2489118771@qq.com。
基金资助:
山西省基础研究计划资助项目“基于LC-MS非靶向代谢组学和RT-qPCR联用挖掘黄酮类黄芪抗根腐病相关代谢物”(202103021224029); 山西省回国留学人员科研资助项目“基于路径分析的山西不同地区仿野生黄芪根腐病发病差异的微生态机制探究”(2022-023)

Fusarium solani Causing Astragalus membranaceus var. mongholicus Root Rot: Establishment of RT-qPCR Detection Method

XU Yingzhi¹(), ZHAO Limei¹, ZU Weixi², GAO Fen³()

¹ Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Shanxi University, Taiyuan 030006
² Department of Hospitality Management, Taiyuan Tourism College, Taiyuan 030032
³ Institute of Applied Chemistry, Shanxi University, Taiyuan 030006

Received:2023-07-07 Revised:2023-10-16 Published:2024-05-23 Online:2024-05-23

摘要/Abstract

摘要：

本研究成功建立了一种针对黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌(Fusarium solani)的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法。该方法基于腐皮镰刀菌翻译延伸因子EF-1α基因序列，设计了特异性引物对FP.F/FP.R，并验证其特异性。建立腐皮镰刀菌的RT-qPCR检测方法；运用所建方法检测黄芪及土壤中腐皮镰刀菌的含量，验证其检测效果。结果表明：设计的引物FP.F/FP.R特异性强，RT-qPCR检测的灵敏度为0.0192 ng/μL，重复性评价显示方法稳定、可靠。应用该RT-qPCR方法，可从黄芪接种发病和疑似发病样本及土壤样本中检测出腐皮镰刀菌。结果表明，3组样本的总阳性检出率均为100%。同时，植株和土壤中腐皮镰刀菌的含量变化与根腐病的严重度基本一致。因此，本研究建立的RT-qPCR方法能够有效地用于黄芪植株及土壤中腐皮镰刀菌的定量检测，为根腐病的早期诊断、预警和病原菌的动态监测提供了重要的技术支持。

关键词: 蒙古黄芪, 根腐病, 腐皮镰刀菌, 实时荧光定量PCR, 早期诊断, 动态监测

Abstract:

The study aimed at establishing a rapid and accurate real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) method for the detection of Fusarium solani, the pathogenic fungus of Astragalus membranaceus var. mongholicus (AMM) root rot. Based on the elongation factor-1α (EF-1α) sequence of F. solani, a pair of specific primers FP.F/FP.R was designed and verified for its specificity. The RT-qPCR detection method was established and then used to detect the DNA content of F. solani in AMM plants and soil samples for verifying its detection effect. The results showed that the designed specific primer FP.F / FP.R was highly specific, and the sensitivity of the established RT-qPCR method was 0.0192 ng/μL. Repeatability evaluation showed that the method was stable and reliable. With the mothed, the pathogen F. solani was detected in F. solani-inoculated and suspected diseased AMM plants as well as soil samples, the positive detection rate being 100% for all samples in the three groups. Meanwhile, the changes of F. solani content in AMM plants and soil samples were consistent with the severity of root rot. The results indicated that the RT-qPCR method could be used in quantitative detection of F. solani in AMM plants and soil to provide technical support for the early diagnosis of and warning against root rot, and the dynamic monitoring of pathogens.

Key words: Astragalus membranaceus var. mongholicus, root rot, Fusarium solani, real-time fluorescent quantitative PCR, early diagnosis, dynamic monitoring

徐英芝, 赵丽梅, 祖未希, 高芬. 黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌的实时荧光定量PCR检测方法建立[J]. 中国农学通报, 2024, 40(15): 110-116.

XU Yingzhi, ZHAO Limei, ZU Weixi, GAO Fen. Fusarium solani Causing Astragalus membranaceus var. mongholicus Root Rot: Establishment of RT-qPCR Detection Method[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2024, 40(15): 110-116.

图/表 6

图1. 腐皮镰刀菌引物FP.F/FP.R的特异性检测 A和B分别为常规PCR及RT-qPCR扩增的结果；M：DL 2000 DNA marker；1~8：分别为腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌、锐顶镰刀菌、芬芳镰刀菌、链格孢菌（阴性对照）、禾谷镰刀菌、木贼镰刀菌、ddH2O（空白对照）

图2. 常规PCR检测引物FP.F/FP.R的灵敏度 M：DL 2000 DNA marker；1-6：浓度分别为107、10.7、1.07、0.107、0.0107、0.00107 ng/μL的腐皮镰刀菌基因组DNA；7：ddH2O（空白对照）

图3. 腐皮镰刀菌基因组DNA的RT-qPCR扩增曲线(A)及标准曲线(B) 1~7：浓度分别为60、12、2.4、0.48、0.096、0.0192、0.00384 ng/μL的腐皮镰刀菌基因组DNA；8：ddH2O（空白对照）

图4. 添加黄芪基因组DNA后的RT-qPCR扩增曲线(A)及标准曲线(B) 1~7：添加了黄芪组织基因组DNA（100 ng/μL，1 μL）的腐皮镰刀菌基因组DNA，浓度同图3；8：ddH2O（空白对照）

模板/(ng/μL)		Cq值	标准差	变异系数/%
^a不同浓度的腐皮镰刀菌基因组DNA	12	22.88	0.22	0.98
	2.4	25.71	0.34	1.31
	0.48	28.65	0.29	1.00
	0.096	31.49	0.25	0.80
	0.0192	34.51	0.56	1.61
^b不同浓度的腐皮镰刀菌基因组DNA	12	23.50	0.33	1.39
	2.4	26.59	0.32	1.20
	0.48	29.37	0.15	0.53
	0.096	32.01	0.07	0.20
	0.0192	34.57	0.33	0.96

表1. RT-qPCR检测体系的重复性评价

样本类型		样本数	检测部位	阳性样本	腐皮镰刀菌含量/(ng/g)
接种发病样本	0 d	3	病斑	3	10.31±3.58 c
	7 d	3		3	179.02±35.54 b
	14 d	3		3	227.25±20.13 a
	21 d	3		3	223.41±93.68 a
疑似发病样本	Ⅰ	3	芯部	3	46.21±13.15 a
	Ⅱ	3	芯部	3	38.48±8.78 a
	Ⅱ	3	病斑	3	38.87±1.85 a
种植地土壤样本	4年生未发病土	3	根围土	3	32.77±8.63 ab
	4年生发病土	3		3	48.74±3.64 a
	5年生未发病土	3		3	15.53±3.77 b
	5年生发病土	3		3	47.57±18.53 a

表2. 黄芪植株及土壤中腐皮镰刀菌的RT-qPCR检测结果

参考文献 21

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Fusarium solani Causing Astragalus membranaceus var. mongholicus Root Rot: Establishment of RT-qPCR Detection Method

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