一种基于PCR的水稻SNP标记检测方法

doi:10.11924/j.issn.1000-6850.casb18120040

摘要/Abstract

摘要：

旨在找到一种简便的SNP检测方法用于水稻种性鉴定及遗传多样性分析,本研究以245份长江中下游主推杂交水稻品种及亲本为研究材料,从1319个SNP位点中筛选出124对多态性高的位点,建立SNP的高效检测体系。选用其中的1个标记sf0141821553和SSR的标记RM7120来检测水稻的纯度,分别利用Caps-AccI标记和SNP-sf0601764762扩增亲本及杂交后代Wx的基因型,两者结果完全一致。用124对位点对245份杂交水稻进行遗传多样性分析,聚类分析显示,245个品种间的遗传相似系数在0.64~0.97之间。以遗传相似系数0.64为阈值,可以将245个水稻品种分为2个类群,这2个类群分别在遗传相似系数为0.712和0.667处又可以分为2个亚群。结果表明材料间存在明显的群体结构,能精确区分待测品种的基因型以及品种间的遗传差异。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳来实现SNP标记的检测,方法简便且不需要大型仪器设备和昂贵的试剂,便于实验室开展水稻品种的鉴定工作。

关键词: 水稻, SNP, 功能基因, 标记筛选, 多态性

Abstract:

This study aims to find a simple SNPs detection method for rice species identification and genetic diversity analysis. 245 main hybrid rice varieties and their parents widely cultivated in the middle-lower reaches of the Yangtze River were used as materials. 124 pairs of highly polymorphic loci were screened out from 1319 SNP loci and an efficient SNP detection system was constructed. One of the selected SNP markers, sf0141821553, and a SSR maker RM7120 were used to identify the purity of hybrid seed. The genotypes of Wx in parental species and hybrid generation groups were amplified by Caps-AccI and SNP-sf0601764762, respectively, and they had the same result. The genetic diversity analysis was conducted with the 124 pairs of loci among the 245 rice varieties. The clustering analysis revealed that the genetic similarity coefficients within the 245 varieties were from 0.64 to 0.97. The 245 varieties were classified into two cluster groups with the similarity coefficient of 0.64. Each of the two cluster groups was further divided into two subgroups with the similarity coefficient of 0.712 and 0.667 respectively. These results showed obvious population structure among these rice varieties, and the genotypes of the tested varieties and the genetic differences among varieties were accurately distinguished. The detection of SNP markers by polyacrylamide gel electrophoresis is simple, and does not require large instruments and expensive reagents, which is convenient for laboratory identification of rice varieties.

Key words: rice, SNP, functional genes, marker screening, polymorphism

中图分类号:

S5-33

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图/表 10

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品种类型	品种名称
常规种/亲本	绍糯9714、天香58、武运粳14、高科1号、天协13、凡7、泸香658、晚粳22、R18、德香4103、宁粳3号、C418、浙农34、早籼788、HP121、中嘉早17、川农2号、皖恢9号、嘉兴8号、糯稻N-2、7NP285、镇稻15、早籼18、XH022、淮稻12、838、M1148、皖稻68、恢52、粤B、黄糯2号、密阳46、R18选、皖垦糯1号、9311、国丰一号、RH003、2428、皖稻197、ZH128、贵9B、嘉育253、红98、SR54、新强8号、R6547、中9B、五山丝苗、R118、NLjR09、粳糯4921、安香2号、II-32B、竹舟5号、川香6号、沪恢6号、早籼65、明恢100、cp120、绿稻24、明恢77、恢527、金奉19、黥香恢788、898、皖稻113、测64、盐559、安选6号、创丰占、零57、早籼15、奉化占、明63、皖稻141、丰美占、IR50、丰优58、广香籼、杨6、皖稻173、黄华占、特青、宁粳2号、皖籼316、成恢448、皖稻84、早籼14、镇江084、绿旱1号、皖稻89、培矮64、天勤1号、中籼898、Li7954、泰香4号、中籼352、万恢88、皖稻191、盐稻8号、R602、皖稻90、泰国籼、Liu3149、丰优188、中香6号、明恢1273、中早33、3263、m125、安育早1号、镇籼96、R-725、早籼2430、C4115、南京16、中籼2503、NIJR05、中香1号、粤航1号、R1846、N456、R-11、海南常规稻、肖37878、KL90、Liu矮、创优2号、IR24、CO39、明86、丰华占、明恢86 、五色黑米、五色红米、红香米、红米、红米早籼、镇籼122、4M92、8019、四丰43、青元矮、春江06、8077s、HL514、IR26、南粳15、紫稻、ZH199、GP15、IR8、黑米、IR64、B5、五常香
两系杂交稻	两优6326、广两优1128、丰两优香一号、广两优香66、II优98、徽两优6号、Y两优1号、科两优889、两优688、Y两优9918、徽两优5号、扬两优6号、深两优865、隆两优6号、丰两优一号、新华两优9号、丰两优9号、广两优76、华两优1206、II优1256、徽两优996、C两优608、深两优862、新两优香4、两优363、两优6326、淮两优3号、丰两优晚三、C两优华占、两优036、两优100、两优华6、广两优100、丰两优三号、新两优98、安两优821、常两优2号、丰两优80
三系杂交稻	中浙优8号、宜优673、冈优1577、新隆优1、甬优10号、天优998、新优188、丰晚籼优1号、春优84、五优308、金优88、辐优138、浙优18、嘉禾优555、中优1671、天优81、钱优0508、欣荣优华占、协优63、开优8号、扬籼优418、天优华占、80优121、中2优1286、甬优538、K优52、Ⅲ优98、新隆粳3号、科优8377、丰优126、协优9019、Ⅱ优8号、川香优2号、丰源优272、协优58、辐优155、甬优1540、荃香优512、丰优293、丰优512、T优15、广籼优4号、Ⅱ优107、辐优136、丰优9号、科优16、庐优855、浙糯优1号、农华优808、怀优4号

品种类型	品种名称
常规种/亲本	绍糯9714、天香58、武运粳14、高科1号、天协13、凡7、泸香658、晚粳22、R18、德香4103、宁粳3号、C418、浙农34、早籼788、HP121、中嘉早17、川农2号、皖恢9号、嘉兴8号、糯稻N-2、7NP285、镇稻15、早籼18、XH022、淮稻12、838、M1148、皖稻68、恢52、粤B、黄糯2号、密阳46、R18选、皖垦糯1号、9311、国丰一号、RH003、2428、皖稻197、ZH128、贵9B、嘉育253、红98、SR54、新强8号、R6547、中9B、五山丝苗、R118、NLjR09、粳糯4921、安香2号、II-32B、竹舟5号、川香6号、沪恢6号、早籼65、明恢100、cp120、绿稻24、明恢77、恢527、金奉19、黥香恢788、898、皖稻113、测64、盐559、安选6号、创丰占、零57、早籼15、奉化占、明63、皖稻141、丰美占、IR50、丰优58、广香籼、杨6、皖稻173、黄华占、特青、宁粳2号、皖籼316、成恢448、皖稻84、早籼14、镇江084、绿旱1号、皖稻89、培矮64、天勤1号、中籼898、Li7954、泰香4号、中籼352、万恢88、皖稻191、盐稻8号、R602、皖稻90、泰国籼、Liu3149、丰优188、中香6号、明恢1273、中早33、3263、m125、安育早1号、镇籼96、R-725、早籼2430、C4115、南京16、中籼2503、NIJR05、中香1号、粤航1号、R1846、N456、R-11、海南常规稻、肖37878、KL90、Liu矮、创优2号、IR24、CO39、明86、丰华占、明恢86 、五色黑米、五色红米、红香米、红米、红米早籼、镇籼122、4M92、8019、四丰43、青元矮、春江06、8077s、HL514、IR26、南粳15、紫稻、ZH199、GP15、IR8、黑米、IR64、B5、五常香
两系杂交稻	两优6326、广两优1128、丰两优香一号、广两优香66、II优98、徽两优6号、Y两优1号、科两优889、两优688、Y两优9918、徽两优5号、扬两优6号、深两优865、隆两优6号、丰两优一号、新华两优9号、丰两优9号、广两优76、华两优1206、II优1256、徽两优996、C两优608、深两优862、新两优香4、两优363、两优6326、淮两优3号、丰两优晚三、C两优华占、两优036、两优100、两优华6、广两优100、丰两优三号、新两优98、安两优821、常两优2号、丰两优80
三系杂交稻	中浙优8号、宜优673、冈优1577、新隆优1、甬优10号、天优998、新优188、丰晚籼优1号、春优84、五优308、金优88、辐优138、浙优18、嘉禾优555、中优1671、天优81、钱优0508、欣荣优华占、协优63、开优8号、扬籼优418、天优华占、80优121、中2优1286、甬优538、K优52、Ⅲ优98、新隆粳3号、科优8377、丰优126、协优9019、Ⅱ优8号、川香优2号、丰源优272、协优58、辐优155、甬优1540、荃香优512、丰优293、丰优512、T优15、广籼优4号、Ⅱ优107、辐优136、丰优9号、科优16、庐优855、浙糯优1号、农华优808、怀优4号

序号	基因名称	表型	序号	基因名称	表型
1	An-1	芒	43	Hd17	开花期
2	An-10	芒	44	Hd3a	生育期
3	An-9	芒	45	Hd6	促进水稻北扩抽穗
4	BADH2	籽粒香味	46	HGW	粒重
5	Bh4	壳红	47	Htd1	株高、分蘖
6	d3	株高	48	HTD2	株高
7	DEP1/qPE9	穗节间变短,直立穗	49	LAX1和SPA	穗分枝
8	DEP2/ep2	直立穗	50	LAX2	产量
9	DEP3	抽穗期	51	Laxy/LA1	株型松散度
10	DLT	株高	52	LOG	茎分生组织活性
11	DPL2	杂交不亲和	53	MOC1	分蘖
12	DTH2和DTH12	促进水稻北扩抽穗	54	NAL1	叶型、产量
13	DTH3	开花期	55	NiR	组培氮利用,氯酸钾解毒等
14	DTH7	开花期	56	NR	硝酸还原酶
15	DTH8/Ghd8	粒重、株高、抽穗期	57	OSC1	稃尖红
16	Dwarf1	株高	58	OSCD1	株高
17	Dwarf10	枝梗	59	OsEBS	株高、叶片大小、小穗数
18	Dwarf14	枝梗	60	OsPH1	株高
19	Dwarf27	枝梗	61	OsPIN2	株型
20	Dwarf3	株高、分蘖	62	OsSOC1	开花时间
21	Dwarf53	枝梗	63	OsSPL14; IPA1;WFP	株型
22	DWT1	主茎分蘖发育一致性	64	OSWOX3B	叶壳绒毛
23	EG1	穗型	65	Phr-1	酚染色
24	Ehd1	生育期	66	PrOG1	匍匐程度
25	Ehd2	开花期	67	qCTS	抗冷性
26	Ehd3	开花期	68	qGL3	粒型、产量
27	Ehd4	开花期	69	Qsd12	休眠性
28	EP2	穗直立性	70	qSD7	休眠性
29	EUI1	穗型	71	qSH1/sh4/SHAT	落粒性
30	GA20x6	株高	72	qSW5/GW5	粒宽
31	GE	种子发育	73	Rc	种皮果皮红
32	Ghd7	影响株高穗粒数生育期	74	Rd	红色素
33	GIF1	粒型	75	S5-n	广亲和
34	GIP1	籽粒充实度	76	SD1	株高
35	GL7/GL7NR	粒型、垩白	77	Sdr4	休眠性
36	Gn1a	产量	78	SP1	穗分枝数及长度
37	GS3	粒型	79	Sui1	穗型
38	GS5	粒重	80	TAC/qTA9	分蘖角大小
39	GW2	粒长	81	TAD1	分蘖
40	GW8	粒重	82	TGW6	粒重
41	Hd1	生育期	83	wx	蜡质
42	Hd16	开花期

序号	基因名称	表型	序号	基因名称	表型
1	An-1	芒	43	Hd17	开花期
2	An-10	芒	44	Hd3a	生育期
3	An-9	芒	45	Hd6	促进水稻北扩抽穗
4	BADH2	籽粒香味	46	HGW	粒重
5	Bh4	壳红	47	Htd1	株高、分蘖
6	d3	株高	48	HTD2	株高
7	DEP1/qPE9	穗节间变短,直立穗	49	LAX1和SPA	穗分枝
8	DEP2/ep2	直立穗	50	LAX2	产量
9	DEP3	抽穗期	51	Laxy/LA1	株型松散度
10	DLT	株高	52	LOG	茎分生组织活性
11	DPL2	杂交不亲和	53	MOC1	分蘖
12	DTH2和DTH12	促进水稻北扩抽穗	54	NAL1	叶型、产量
13	DTH3	开花期	55	NiR	组培氮利用,氯酸钾解毒等
14	DTH7	开花期	56	NR	硝酸还原酶
15	DTH8/Ghd8	粒重、株高、抽穗期	57	OSC1	稃尖红
16	Dwarf1	株高	58	OSCD1	株高
17	Dwarf10	枝梗	59	OsEBS	株高、叶片大小、小穗数
18	Dwarf14	枝梗	60	OsPH1	株高
19	Dwarf27	枝梗	61	OsPIN2	株型
20	Dwarf3	株高、分蘖	62	OsSOC1	开花时间
21	Dwarf53	枝梗	63	OsSPL14; IPA1;WFP	株型
22	DWT1	主茎分蘖发育一致性	64	OSWOX3B	叶壳绒毛
23	EG1	穗型	65	Phr-1	酚染色
24	Ehd1	生育期	66	PrOG1	匍匐程度
25	Ehd2	开花期	67	qCTS	抗冷性
26	Ehd3	开花期	68	qGL3	粒型、产量
27	Ehd4	开花期	69	Qsd12	休眠性
28	EP2	穗直立性	70	qSD7	休眠性
29	EUI1	穗型	71	qSH1/sh4/SHAT	落粒性
30	GA20x6	株高	72	qSW5/GW5	粒宽
31	GE	种子发育	73	Rc	种皮果皮红
32	Ghd7	影响株高穗粒数生育期	74	Rd	红色素
33	GIF1	粒型	75	S5-n	广亲和
34	GIP1	籽粒充实度	76	SD1	株高
35	GL7/GL7NR	粒型、垩白	77	Sdr4	休眠性
36	Gn1a	产量	78	SP1	穗分枝数及长度
37	GS3	粒型	79	Sui1	穗型
38	GS5	粒重	80	TAC/qTA9	分蘖角大小
39	GW2	粒长	81	TAD1	分蘖
40	GW8	粒重	82	TGW6	粒重
41	Hd1	生育期	83	wx	蜡质
42	Hd16	开花期

序号	SNP位点	上游引物01	上游引物02	下游引物	下游引物TM
1	sf0101046878	5’ctttagtaagagttggactgcGtt	5’ctttagtaagagttggactgcatg	acaaattcttactggccttcaaga	58.615
2	sf0105530098	5’gtgagggggggttttattggAct	5’gtgagggggggttttattgggcg	gccagccaagtcactcacaagc	64.436
3	sf0105567692	5’gccagaatttaccatcaCgt	5’gccagaatttaccatcatgc	tgctgcttctgcctctctcaca	63.899
4	sf0121636668	5’catccgagagtgttgcGcc	5’catccgagagtgttgctcg	tcccgcctttcagtgtaccagt	63.598
5	sf0121636700	5’ctgtggcatagaaggCtg	5’ctgtggcatagaaggatt	cctggcactcctaccatgcct	63.953
6	sf0121636862	5’gaattcatgaaatctccGgt	5’gaattcatgaaatctccagc	ctggcccatgtcctccagcc	65.068
7	sf0121639360	5’gcttccaacctttttctctttgtaccGgc	5’gcttccaacctttttctctttgtaccagt	gaaccctccagtgagaagaaataca	60.28
8	sf0121639399	5’gaggtaaattacaatgcccGtt	5’gaggtaaattacaatgcccata	tccgtgaaatttcagaaccctcca	62.273
9	sf0121640072	5’gaattcatcttttcaacaTac	5’gaattcatcttttcaacagaa	gccttccaatggacctggcca	65.056
10	sf0122352734	5’gcatctctcacccctttGac	5’gcatctctcacccctttaat	tctgtattggaacggcaatgagc	61.482
11	sf0122352787	5’gtgaaggggacttgtccaTga	5’gtgaaggggacttgtccaggt	tgcaggtgacagttggtccca	63.956
12	sf0122378237	5’ggacgcccgccggccggggcgAcg	5’ggacgcccgccggccggggcggca	tctacgacgagccgcctcct	65.006
13	sf0122379409	5’gcaattcttttctaggtAcg	5’gcaattcttttctaggtgcc	cgggcgctctaatggcattgc	64.883
14	sf0122955834	5’catcatcctagtagaaaCat	5’catcctagtagaaaaag	tgtgtgccgtagtttgcatccga	65.056
15	sf0127290109	5’ggtaacgtccacgtgcaAtt	5’ggtaacgtccacgtgcactg	cgtcgatcgccaccgtgtct	64.915
16	sf0127291516	5’gtcgatgagagaaagatctatagctaTcc	5’gtcgatgagagaaagatctatagctagct	ctctcgtccaatccggccgg	65.056
17	sf0133308542	5’gacccggcgctcgccgGcg	5’gacccggcgctcgccgact	gccctagcgcactcgtcctc	65.029
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