不同蜜环菌菌株的鉴定及胞外酶活性研究

doi:10.11924/j.issn.1000-6850.casb20191000716

中国农学通报 ›› 2020, Vol. 36 ›› Issue (24): 99-106.doi: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb20191000716

所属专题：生物技术

不同蜜环菌菌株的鉴定及胞外酶活性研究

刘晓敏¹^,²(), 陈向东², 张薇薇², 王忠巧³, 宋明海⁴, 兰进², 马琳¹()

¹天津中医药大学,天津 301617
²中国医学科学院&北京协和医学院药用植物研究所,北京 100193
³彝良县天麻产业开发办公室,云南昭通 657600
⁴抚松县参王植保有限责任公司,吉林抚松 134500

收稿日期:2019-10-13 修回日期:2019-11-15 出版日期:2020-08-25 发布日期:2020-08-20
通讯作者: 马琳
作者简介:刘晓敏,女,1992年出生,河北承德人,硕士研究生,研究方向：中药学和药用真菌。通信地址：301617 天津天津市静海区团泊新城北华南路天津中医药大学新区,Tel：13622029577,E-mail：1908388664@qq.com。
基金资助:
吉林省科技发展计划项目“长白山乌天麻林下仿生栽培技术集成与基地建设”(20180201040YY)

Identification of Different Armillaria spp. Strains and Extracellular Enzyme Activity

Liu Xiaomin¹^,²(), Chen Xiangdong², Zhang Weiwei², Wang Zhongqiao³, Song Minghai⁴, Lan Jin², Ma Lin¹()

¹Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617
²Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193
³Tianma Industry Development Office of Yanliang, Zhaotong Yunnan 657600
⁴Fu Song County Shen Wang Plant Protection Co., Ltd., Fusong Jilin 134500

Received:2019-10-13 Revised:2019-11-15 Online:2020-08-25 Published:2020-08-20
Contact: Ma Lin

摘要/Abstract

摘要：

旨在鉴定伴栽天麻的不同蜜环菌菌株,通过比较其胞外酶活性及多糖含量的变化规律,为筛选优质菌株提供依据。以M1、M2、F2、F3菌株为试材,采用ITS、β-tubulin及Tef1-α基因片段的合并序列构建系统发育树,采用ABTS法和DNS法测定胞外酶活性,苯酚-硫酸法测得菌丝体多糖含量。由系统发育分析可知,由云南基地分离的M1、M2菌株为高卢蜜环菌(Armillaria gallica Marxm. & Romagn.),由吉林基地分离的F2、F3菌株为头柄蜜环菌(Armillaria cepistipes Velen.)。比较生长速度结果显示,M1、M2、F2菌株的生长速度较快,F3菌株最慢。胞外酶活性及多糖含量实验结果表明,4个菌株的胞外酶活性和多糖含量均呈现先升高后下降的趋势,M1、M2菌株的胞外酶活性更强,多糖含量更高。综合分析研究结果,鉴定M1、M2、F2、F3菌株分属高卢蜜环菌和头柄蜜环菌。结合前期的天麻产量结果,初步确认M1、M2菌株为伴栽天麻的优良菌株。

关键词: 蜜环菌, 分子鉴定, 胞外酶, 多糖

Abstract:

The aim is to identify different Armillaria spp. strains associated with cultivated Gastrodia elata, and to provide a basis for screening the excellent strains by comparing the changes of extracellular enzyme activity and polysaccharide content. In this study, M1, M2, F2, and F3 strains were used as test materials, and the phylogenetic tree was constructed by the combined sequences of ITS, β-tubulin and Tef1-α gene fragments. The extracellular enzyme activity was determined by the ABTS and DNS method. The mycelial polysaccharide content was determined by the phenol-sulfuric acid method. According to phylogenetic analysis, the M1 and M2 strains isolated from the Yunnan G. elata base were Armillaria gallica Marxm. & Romagn. The F2 and F3 strains isolated from the Jilin G. elata base were Armillaria cepistipes Velen. The growth rate comparison showed that the growth rates of M1, M2, and F2 were relatively fast and that of F3 was the slowest. The results showed that the extracellular enzyme activity and polysaccharides content of the four Armillaria spp. strains increased at the beginning and then decreased. The M1 and M2 strains of Armillaria gallica had relatively high enzyme activities and polysaccharides content. Based on the comprehensive analysis, the four strains were identified as Armillaria gallica and Armillaria cepistipes, respectively. Combining with the previous G. elata production results, it could be preliminarily confirmed that M1 and M2 strains are excellent strains for cultivating G. elata.

Key words: Armillaria spp., molecular identification, extracellular enzyme, polysaccharide

中图分类号:

刘晓敏, 陈向东, 张薇薇, 王忠巧, 宋明海, 兰进, 马琳. 不同蜜环菌菌株的鉴定及胞外酶活性研究[J]. 中国农学通报, 2020, 36(24): 99-106.

Liu Xiaomin, Chen Xiangdong, Zhang Weiwei, Wang Zhongqiao, Song Minghai, Lan Jin, Ma Lin. Identification of Different Armillaria spp. Strains and Extracellular Enzyme Activity[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2020, 36(24): 99-106.

图/表 10

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扩增对象	引物名称	引物序列(5′-3′)
rDNA	ITS-1	5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′
rDNA	ITS-4	5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′
β-tubulin	TUB F	5′-GGTGCGGG TAACTGGGC-3′
β-tubulin	TUB R	5′-GAGGCAGCCATCATGTTCTT-3′
Tef1-α	EF526F	5′GTCGTYGTYATYGGHCAYGT- 3′
	EF1567R	5′ACHGTRCCRATACCACCRATCTT- 3′
	EF595F	5′CGTGACTTCATCAAGAACATG- 3′
	EF1160R	5′CCGATCTTGTAGACGTCCTG- 3′
阳性克隆菌液	M13F	5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3＇
阳性克隆菌液	M13R	5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′

扩增对象	引物名称	引物序列(5′-3′)
rDNA	ITS-1	5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′
rDNA	ITS-4	5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′
β-tubulin	TUB F	5′-GGTGCGGG TAACTGGGC-3′
β-tubulin	TUB R	5′-GAGGCAGCCATCATGTTCTT-3′
Tef1-α	EF526F	5′GTCGTYGTYATYGGHCAYGT- 3′
	EF1567R	5′ACHGTRCCRATACCACCRATCTT- 3′
	EF595F	5′CGTGACTTCATCAAGAACATG- 3′
	EF1160R	5′CCGATCTTGTAGACGTCCTG- 3′
阳性克隆菌液	M13F	5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3＇
阳性克隆菌液	M13R	5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′

时间	生长速度/(cm/d)
时间	M1	M2	F2	F3
4	0.202±0.061bc	0.349±0.021a	0.254±0.014b	0.169±0.009c
8	0.738±0.059b	0.821±0.070a	0.703±0.072b	0.499±0.062c
12	0.810±0.008a	0.792±0.006a	0.752±0.078a	0.591±0.035b
16				0.534±0.011
20				0.487±0.011

时间	生长速度/(cm/d)
时间	M1	M2	F2	F3
4	0.202±0.061bc	0.349±0.021a	0.254±0.014b	0.169±0.009c
8	0.738±0.059b	0.821±0.070a	0.703±0.072b	0.499±0.062c
12	0.810±0.008a	0.792±0.006a	0.752±0.078a	0.591±0.035b
16				0.534±0.011
20				0.487±0.011

胞外酶	生长速度			多糖
胞外酶	菌株	r值	P值	菌株	r值	P值
漆酶	M1、M2、F2、F3	0.854	<0.01	M1、M2	0.811	<0.01
纤维素酶	M1、M2、F2、F3	0.785	<0.01	M1、M2、F2、F3	0.758	<0.01
淀粉酶	M1	0.796	<0.01	M1	0.961	<0.01
木聚糖酶	M1、M2、F2、F3	0.890	<0.01	M1、M2、F3	0.874	<0.01
果胶酶	M1、M2、F2、F3	0.918	<0.01	M1	0.784	<0.01

不同蜜环菌菌株的鉴定及胞外酶活性研究

Identification of Different Armillaria spp. Strains and Extracellular Enzyme Activity

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