水蛭素的HPLC色谱分析条件优化研究

doi:10.11924/j.issn.1000-6850.casb2023-0423

中国农学通报 ›› 2024, Vol. 40 ›› Issue (11): 142-147.doi: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb2023-0423

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水蛭素的HPLC色谱分析条件优化研究

黄伟¹^,³(), 邓斌², 王议娴³, 陈康³, 饶荣通³, 杨秀娟³^,⁴()

¹ 昆明学院农学与生命科学学院，昆明 650214
² 云南省农村科技服务中心，昆明 650224
³ 云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201
⁴ 云南省动物营养与饲料重点实验室，昆明 650201

收稿日期:2023-05-31 修回日期:2023-08-23 出版日期:2024-04-15 发布日期:2024-04-11
通讯作者:
杨秀娟，副教授，博士，研究方向：药用动物资源利用与开发。通信地址：650201 云南省昆明市盘龙区黑金路云南农业大学动物科学技术学院，Tel：0871-65220061，E-mail：360667320@qq.com。
作者简介:
黄伟，女，1987年出生，副教授，博士，研究方向：特种经济动物养殖。通信地址：650214 云南省昆明市经开区浦新路2号昆明学院， E-mail：873609727@qq.com。
基金资助:
云南省重大科技专项计划“药用动物源性中药材质量控制体系建设”(2018ZF012)

Optimization of HPLC Conditions for Analysis of Hirudin

HUANG Wei¹^,³(), DENG Bin², WANG Yixian³, CHEN Kang³, RAO Rongtong³, YANG Xiujuan³^,⁴()

¹ College of Agronomy and Life Sciences, Kunming University, Kunming 650214
² Yunnan Rural Science and Technology Service Center, Kunming 650224
³ Faculty of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201
⁴ Yunnan Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science, Kunming 650201

Received:2023-05-31 Revised:2023-08-23 Published:2024-04-15 Online:2024-04-11

摘要/Abstract

摘要：

为研究水蛭素的HPLC最佳色谱分析条件，通过对比重组水蛭素的HPLC分析方法的洗脱条件、检测波长、色谱柱的分离效果，拟合水蛭素浓度与峰面积的线性方程，优选最佳水蛭素色谱分析条件。结果显示，ODSC₁₈柱分析最佳条件为：采用梯度洗脱，流动相A和B洗脱程序：0~60 min，B：0%~100%，进样量20 μL，柱温35℃，流速为1 mL/min，波长205 nm；TSKgelG2000SW柱最佳分析条件为：流动相磷酸缓冲液(0.02 mol/L，pH 7.0)，流速0.5 mL/min，检测波长205 nm，进样量20 μL。研究表明，水蛭素浓度与峰面积具有良好的直线线性相关关系，采用TSKgelG2000SW色谱柱的分析效果优于ODSC₁₈柱，可为动物活性多肽的分析提供依据。

关键词: 水蛭素, 液相色谱, 色谱柱, 色谱条件, 分离效果

Abstract:

In order to study the optimal chromatographic conditions for the HPLC analysis of hirudin, we compared the elution conditions, detection wavelengths and separation effects of the HPLC methods for recombinant hirudin, fitted the linear equations of hirudin concentration and peak area, and optimized the hirudin chromatographic analysis conditions. The results showed that the optimal conditions for the analysis on the ODSC₁₈column were as follows: gradient elution, mobile phases A and B elution program: 0~60 min, B: 0%~100%, injection volume of 20 μL, column temperature of 35℃, flow rate of 1 mL/min, and wavelength of 205 nm. And the optimal conditions for the analysis on the TSKgelG2000SW column were as follows: mobile phase’s phosphate buffer (0.02 mol/L, pH 7.0), flow rate of 0.5 mL/min, and wavelength of 205 nm, injection volume of 20 μL. The study showed that the concentration of hirudin had a good linear correlation with the peak area, and the analytical effect of the TSKgelG2000SW column was better than that of the ODSC18 column, which could be used for the analysis of the active peptides in animals.

Key words: Hirudin, HPLC, chromatographic column, chromatographic conditions, separation effect

黄伟, 邓斌, 王议娴, 陈康, 饶荣通, 杨秀娟. 水蛭素的HPLC色谱分析条件优化研究[J]. 中国农学通报, 2024, 40(11): 142-147.

HUANG Wei, DENG Bin, WANG Yixian, CHEN Kang, RAO Rongtong, YANG Xiujuan. Optimization of HPLC Conditions for Analysis of Hirudin[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2024, 40(11): 142-147.

图/表 13

梯度洗脱	流动相组成	洗脱程序
1	A：水（含0.1%TFA） B：60%乙腈（含0.1%TFA）	0~30 min：0~20%B 30~60 min：20%~50%B 60~90 min：50%~80%B
2	A：水（含0.1%TFA） B：60%乙腈（含0.1%TFA）	0~20 min：0~20%B 20~40 min：20%~50%B 40~90 min：50%~80% B
3	A：水（含0.1%TFA） B：60%乙腈（含0.1%TFA）	0~90 min：0~100%B
4	A：水（含0.1%TFA） B：60%乙腈（含0.1%TFA）	0~60 min：0~100%B

表1. ODSC18色谱柱分析条件组成

图1. 梯度洗脱1下的重组水蛭素色谱图

图2. 梯度洗脱2下的重组水蛭素色谱图

图3. 梯度洗脱3下的重组水蛭素色谱图

图4. 梯度洗脱4下的重组水蛭素色谱图

图5. 重组水蛭素紫外扫描图谱

图6. 不同波长条件下重组水蛭素分离峰面积比较图

图7. 重组水蛭素的ODSC18柱分离色谱图

图8. 重组水蛭素的TSKgelG2000SW柱分离色谱图

图9. 不同色谱柱对水蛭素分离峰面积比较图

色谱柱	ODSC18柱	TSKgelG2000SW柱
峰面积测定值	12744013	65565155
	11854013	62765996
	12041143	64026913
	12650003	61625896
	12195138	64025897
	11954755	61725894
平均值	12239844.17	63289291.83
RSD/%	2.78	2.21

表2. 精密度试验结果

图10. 重组水蛭素的ODSC18柱分离的线性回归图

图11. 重组水蛭素的TSKgelG2000SW柱线性回归图

参考文献 31

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Optimization of HPLC Conditions for Analysis of Hirudin

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