一种高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌的构建研究

doi:10.11924/j.issn.1000-6850.casb20191000699

中国农学通报 ›› 2020, Vol. 36 ›› Issue (30): 98-105.doi: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb20191000699

一种高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌的构建研究

夏树立¹(), 韩静¹, 王丽学², 杨春蕾¹, 刘长悦³, 王海亮⁴, 吴贶⁵, 史慧玲¹()

¹天津市畜牧兽医研究所,天津 300380
²天津市农业科学院信息研究所,天津 300192
³天津科润农业科技股份有限公司黄瓜研究所,天津 300192
⁴天津市现代农业科技创新基地管理中心,天津 301700
⁵天津市农业科学院,天津 300192

收稿日期:2019-10-09 修回日期:2019-11-13 出版日期:2020-10-25 发布日期:2020-10-16
通讯作者: 史慧玲
作者简介:夏树立,男,1971年出生,副研究员,本科,研究方向：家禽育种、生态养殖、非常规饲料资源研发,主持、参与国家和省级科研项目25项,获得全国农牧渔业丰收奖二等奖,著作8部,授权发明专利15项。通信地址：300380 天津市西青区津静公路17公里处天津市畜牧兽医研究所,Tel：022-83726967,E-mail： tjxmsxshl@sina.com。
基金资助:
天津市科技重大专项与工程“农村科技帮扶工程：家禽特色蛋品标准化生产技术集成与应用”(18ZXBFNC00350);天津市农业科学院青年科技创新重点项目“非抗性稳定高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌工程菌株的构建及应用”(201801)

A Strain of Bacillus subtilis Producing High-Yield L-lysine: Construction

Xia Shuli¹(), Han Jing¹, Wang Lixue², Yang Chunlei¹, Liu Changyue³, Wang Hailiang⁴, Wu Kuang⁵, Shi Huiling¹()

¹Tianjin Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Tianjin 300380
²Tianjin Institute of Agricultural Sciences Information Institute, Tianjin 300192
³Tianjin Branch of Tianjin Kerun Agricultural Technology Co., Ltd., Tianjin 300192
⁴Tianjin Modern Agricultural Science and Technology Innovation Base Management Center, Tianjin 301700
⁵Tianjin Academy of Agricultural Sciences, Tianjin 300192

Received:2019-10-09 Revised:2019-11-13 Online:2020-10-25 Published:2020-10-16
Contact: Shi Huiling

摘要/Abstract

摘要：

为了选育一种非抗性、高产出、遗传稳定性好、低生产成本的L-赖氨酸生产菌株,以辣椒花药和枯草芽孢杆菌为试验材料,以穿梭表达载体pHT43和基因敲除载体pK18mobsacB为媒介,将辣椒花药中的高赖氨酸基因CFLR转化到枯草芽孢杆菌中。经过2次细胞内同源交换和培养基筛选,最终获得不带质粒抗性标记的高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌株CMCC(B)63501/pK18mobsacB-ΔALA::CFLR,该菌株连续传代20次后仍具有明显高于野生型的CFLR基因拷贝数,经HPLC验证,重组菌株L-赖氨酸含量比野生菌株提高了64.89%。结果表明,本研究所构建的非抗性高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌株产量高、遗传稳定性好、低纯化成本,具有良好的应用潜力。

关键词: 辣椒高赖氨酸基因, 枯草芽孢杆菌, 基因克隆, 同源交换, HPLC

Abstract:

To breed a strain producing L-lysine with non-resistance, high yield, good genetic stability, low production cost, pepper anther and Bacillus subtilis were used as test materials, the shuttle expression vector pHT43 and gene knockout vector pK18mobsacB was performed as a vector to transform lysine-rich protein gene (CFLR) into Bacillus subtilis. After two rounds of self-recombination and screening of culture medium, the final strain CMCC (B) 63501/pK18mobsacB-ΔALA::CFLR, with high yield of L-lysine was obtained without antibiotic resistance. After 20 generations of serial passage, the strain still expressed a significant higher number of CFLR copies than the wild type. The subsequent data of High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) revealed that the content of L-lysine in recombinant strain was 64.89% higher than that of the wild strain. The above results indicated that the recombinant strain we constructed were featured with non-resistance, high yield, good genetic stability and low purification cost. Therefore, the strain exhibits outstanding potential for future applications.

Key words: CFLR gene, Bacillus subtilis, gene cloning, homologous exchange, HPLC

中图分类号:

夏树立, 韩静, 王丽学, 杨春蕾, 刘长悦, 王海亮, 吴贶, 史慧玲. 一种高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌的构建研究[J]. 中国农学通报, 2020, 36(30): 98-105.

Xia Shuli, Han Jing, Wang Lixue, Yang Chunlei, Liu Changyue, Wang Hailiang, Wu Kuang, Shi Huiling. A Strain of Bacillus subtilis Producing High-Yield L-lysine: Construction[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2020, 36(30): 98-105.

图/表 9

图1. CFLR克隆及鉴定结果 A：CFLR克隆产物电泳结果,其中M为Trans 2K DNA Marker,1为克隆产物;B：pHT43-CFLR克隆电泳结果,其中1~10为不同的单克隆,CK-和CK+分别为阴性（模板为ddH2O）和阳性对照（模板为CFLR克隆产物）;C：GeneBank收录序列（EU367999）与PCR产物及部分阳性克隆测序结果比对

图2. pK18mobsacB-ΔALA的构建 A：枯草芽孢杆菌ALA突变构建流程示意图;B：左边界序列alaT-L（泳道1）和右边界序列alaT-R（泳道2）的克隆;C：alaT克隆结果;D：pK18mobsacB载体、alaT片段酶切后电泳图片;E：PCR鉴定克隆,其中CK+和CK-分别为阳性对照（alaT为模板）和阴性对照（模板为ddH2O）,引物为ALAT-RF/ALAT-RR,产物773 bp

图3. 酶切鉴定重组质粒pK18mobsacB-ΔALA::CFLR A：pK18mobsacB-ΔALA酶切电泳图片,其中泳道1和2分别为酶切后产物和对照质粒,M为Trans 2K Plus II DNA marker;B：Pgac-CFLR片段扩增结果;C：pK18mobsacB-ΔALA- CFLR构建克隆鉴定结果,其中1~7为不同的克隆,CK+和CK-分别为阳性对照（Pgac-CFLR片段为模板）和阴性对照（模板为ddH2O）,引物为Pgac-F/CFLR-R;B和C中M为Trans 2K DNA marker

图4. 菌落PCR验证CFLR基因 1：重组枯草芽孢杆菌株;2：野生型菌株

图5. 枯草芽孢杆菌筛选结果 1：枯草芽孢杆菌;2：转化pK18 mobsacB载体的枯草芽孢杆菌;3：转化pK18mobsacB-ΔALA-CFLR后经过筛选的重组枯草芽孢杆菌

图6. SDS-PAGE凝胶电泳检测CFLR蛋白诱导表达结果

图7. 赖氨酸标准曲线

图8. 赖氨酸标准品衍生液的HPLC结果

图9. HPLC测定枯草芽胞杆菌中赖氨酸的含量

参考文献 21

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A Strain of Bacillus subtilis Producing High-Yield L-lysine: Construction

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