转基因玉米CM8101特异性定性PCR检测方法

doi:10.11924/j.issn.1000-6850.casb2020-0576

摘要/Abstract

摘要：

旨在为转基因安全监管提供技术支撑,本研究建立了转基因玉米CM8101定性检测方法。根据CM8101转基因玉米插入序列信息,于3′端侧翼序列处设计PCR引物。通过扩增体系优化、特异性测试、灵敏度测试、稳定性测试等技术参数的测试建立了转基因玉米CM8101定性检测方法。结果表明:本特异性检测方法各项参数符合相关转基因分子检测标准的要求,具有良好的品系特异性,方法检测灵敏度可达0.1%。CM8101是中国自主研发的具有产业化应用前景的转基因玉米新品系,本方法为品系和其衍生产品的鉴定提供技术手段。

关键词: 转基因玉米, CM8101, 定性方法, 分子检测, PCR, 特异性

Abstract:

To provide technical support for GM (genetically modified) safety supervision, a qualitative detection method for GM maize CM8101 was established. According to the insertion sequence information of CM8101, PCR primers were designed in the 3' end flanking sequence. Through the amplification system optimization, the specificity test, sensitivity and stability tests, a specific method of CM8101 was developed. The results showed that all test parameters of this method met the requirements of transgenic molecular detection standard. The method had good specificity, and the detection sensitivity reached 0.1%. CM8101 is a new transgenic maize line with industrial application prospect independently developed in China, so this method can provide a technical means for the identification of CM8101 and its derives.

Key words: transgenic maize, CM8101, qualitative method, molecular detection, PCR, specificity

中图分类号:

S188

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图/表 9

样品名称	包括的转化体
转基因玉米混合物	Bt11、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460、MIR162、DAS40278-9、4114、MON87427、5307、 MON89034
转基因大豆混合物	GTS40-3-2、MON89788、CV127、A5547-127、A2704-12、305423、356043、MON87769、 MON87705、FG72、DAS68416-4
转基因棉花混合物	MON15985、LLCOTTON25、MON1445、MON531 、MON88913
转基因油菜混合物	GT73、MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2

表1. 特异性测试包含的转基因作物

引物名称	引物序列(5’--3’)	引物长度/bp	产物大小/bp	位置
8101-F1	GTGCCAGAGTCAACCCA	17	132	5’端
8101-R1	ATTCGGCGTTAATTCAGTAC	20	132	5’端
8101-F2	ATCCCAACATGAGCTAGTCG	20	179	5’端
8101-R2	GCCTGAATGGCGAATGCTA	19	179	5’端
8101-F3	GAGTCAACCCATGTTAGTCT	20	150	5’端
8101-R3	GCCTGAATGGCGAATGCTA	19	150	5’端
8101-F4	GTGCCAGAGTCAACCCA	17	177	5’端
8101-R4	GCCCTTCCCAACAGTTGC	18	177	5’端
8101- F5	GGAGAGGCGGTTTACGAGTTT	21	100	3’端
8101- R5	GTCAAAACCTCACCCCACA	19	100	3’端
8101- F6	GGAGAGGCGGTTTACGAGTTT	21	197	3’端
8101- R6	GCCATTGATCGTCGACCAG	19	197	3’端
8101- F7	GGAAGCATAAAGTGTAAAGCC	21	242	3’端
8101- R7	CATTTCTTGGTCAAAACCTCAC	22	242	3’端

表2. CM8101玉米特异性定性PCR检测引物信息

图1. CM8101玉米的3’端边界序列及引物位置划线序列为CM8101外源插入片段的部分序列;未划线序列为3’端玉米基因组部分序列突出显示序列为上、下游引物结合位点。

图2. 特异性测试样品内标准基因zSSIIb扩增结果 M:DL2000 Marker;1:空白对照;2:阴性对照;3:CM8101转基因玉米样品;4:其他转基因玉米混合样品;5:转基因大豆混合样品;6:转基因水稻混合样品;7:转基因油菜混合样品;8:转基因棉花混合样品

图3. 特异性测试样品CM8101特异性片段扩增结果 M:DL2000 Marker;1:空白对照;2:阴性对照;3:CM8101转基因玉米样品;4:其他转基因玉米混合样品;5:转基因大豆混合样品;6:转基因水稻混合样品;7:转基因油菜混合样品;8:转基因棉花混合样品

图4. 灵敏度测试样品内标准基因zSSIIb扩增结果 M:DL2000分子量标记;1:空白对照;2:阴性对照;3:1% CM8101;4:0.5% CM8101;5:0.1% CM8101;6:0.05% CM8101;7:0.01% CM8101

图5. 灵敏度测试样品CM8101特异性片段扩增结果 M:DL2000分子量标记;1:空白对照;2:阴性对照;3:1% CM8101;4:0.5% CM8101;5:0.1% CM8101;6:0.05% CM8101;7:0.01% CM8101

图6. CM8101玉米检测方法检出限测定 M:DL2000分子量标准;B:空白对照;N:非转基因玉米;1~60:CM8101玉米样品（质量分数为0.1%）

图7. CM8101玉米特异性PCR法退火温度的稳定性测试 M:DL2000分子量标准;B:空白对照;N:非转基因玉米

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