利用氦氖激光诱变提高枯草芽孢杆菌纤溶酶活力的研究

doi:10.11924/j.issn.1000-6850.casb20191201001

中国农学通报 ›› 2020, Vol. 36 ›› Issue (35): 28-36.doi: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb20191201001

所属专题：生物技术

利用氦氖激光诱变提高枯草芽孢杆菌纤溶酶活力的研究

孙莹¹^,²(), 王海曼¹^,², 宋刚¹^,², 葛菁萍¹^,²()

¹黑龙江大学生命科学学院,黑龙江省普通高校微生物重点实验室,哈尔滨 150080
²黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心,哈尔滨 150080

收稿日期:2019-12-26 修回日期:2020-02-06 出版日期:2020-12-15 发布日期:2020-12-18
通讯作者: 葛菁萍
作者简介:孙莹,女,1994年出生,黑龙江哈尔滨人,硕士研究生,研究方向：微生物学。通信地址：150080 黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路74号黑龙江大学224信箱,Tel：0451-86609016,E-mail： sunying9557@126.com。
基金资助:
黑龙江省科技攻关重大项目“传统发酵豆酱制品菌群动态分析及功能菌的应用”(GA07B401-6);哈尔滨市科技局科技创新人才研究专项资金项目优秀学科带头人(RC2010XK002028)

He-Ne Laser Mutagenesis Increasing the Fibrinolytic Enzyme Activity of Bacillus subtilis

Sun Ying¹^,²(), Wang Haiman¹^,², Song Gang¹^,², Ge Jingping¹^,²()

¹Key Laboratory of Microbiology of Heilongjiang Province, Life Science College, Heilongjiang University, Harbin 150080
²Agricultural Microorganisms Technology Education Engineering Research Center, Harbin 150080

Received:2019-12-26 Revised:2020-02-06 Online:2020-12-15 Published:2020-12-18
Contact: Ge Jingping

摘要/Abstract

摘要：

通过诱变筛选纤溶酶活性高的枯草芽孢杆菌菌株,得到突变株HDBF-N7HN5。使用氦氖激光诱变,设置不同的诱变时间,通过不同的蛋白平板处理,筛选高产突变株并检测纤溶酶活力。实验结果表明,在氦氖激光诱变处理45 min后,最高产突变株纤溶酶活力达到429.89±5.74 IU/mL。突变株经过10次传代培养后,保持稳定的高产纤溶酶特性。纤溶酶粗酶液处理血凝块的绝对溶解率可达到57.74±0.72%,10倍稀释液处理血凝块的绝对溶解率也能达到26.89±0.68%,菌株产生的纤溶酶具有良好的体外溶栓效果。本研究结果既提高了微生物纤溶酶活性,也为该菌株产纤溶酶的产业化提供了依据。

关键词: 纤溶酶, 氦氖激光诱变, 诱变育种, 酶学性质, 枯草芽孢杆菌

Abstract:

The mutant strain HDBF-N7HN5 was obtained by inducing and selecting Bacillus subtilis strain with high fibrinolytic enzyme. He-Ne Laser mutagenesis was conducted in this study with different mutant time. The mutant strains were selected and the activities of fibrinolytic enzyme were detected with different fibrin plates. The results showed that after 45 min with He-Ne Laser mutagenesis, the fibrinolytic enzyme activity of the mutant strain with the highest yield reached 429.89±5.74 IU/mL. The genetic stability analysis of HDBF-N7HN5 indicated that the production of fibrinolytic enzyme was very stable after 10 generation cultivation. The absolute dissolution rate of blood clot treated with crude fibrinolytic solution reached 57.74±0.72%, and the absolute dissolution rate of blood clot treated with 10-fold dilution could also reach 26.89±0.68%. The fibrinolytic enzyme produced by the strain had good thrombolytic effect in vitro. The results of this study not only increase the microbial fibrinolytic activity, but also provide a basis for the industrialization of fibrinolytic produced by this strain.

Key words: fibrinolytic enzyme, He-Ne laser mutagenesis, mutation breeding, enzymology properties, Bacillus subtilis

中图分类号:

S182

孙莹, 王海曼, 宋刚, 葛菁萍. 利用氦氖激光诱变提高枯草芽孢杆菌纤溶酶活力的研究[J]. 中国农学通报, 2020, 36(35): 28-36.

Sun Ying, Wang Haiman, Song Gang, Ge Jingping. He-Ne Laser Mutagenesis Increasing the Fibrinolytic Enzyme Activity of Bacillus subtilis[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2020, 36(35): 28-36.

图/表 16

试剂	来源
牛血纤维蛋白	国药品生物制品检定所
牛凝血酶	国药品生物制品检定所
尿激酶原	国药品生物制品检定所
其他试剂	为国产分析纯

表1. 实验试剂来源

图1. 氦氖激光对突变株B.sub HDBF-DJ3N7诱变的致死率

图2. 氦氖激光对突变株HDBF-DJ3N7的诱变效应

图3. 纤维蛋白平板法测定突变株纤溶酶活力

图4. 突变株HDBF-N7HN5在纤维蛋白平板上的水解圈

图5. 菌株HDBF-DJ3诱变前后在LB平板上培养24 h的菌落形态对比 a：菌株HDBF-DJ3,b：突变株HDBF-N7HN5

图6. 菌株HDBF-DJ3诱变前后显微形态对比 a：菌株HDBF-DJ3,b：突变株HDBF-N7HN5

图7. 突变株HDBF-N7HN5遗传稳定性分析

图8. 尿激酶标准曲线

图9. 经85℃加热处理30 min的纤维蛋白平板（阴性平板）上各样品形成的水解圈

图10. 纤维蛋白降解过程分析泳道1：0.1%的牛纤维蛋白原溶液;泳道2-6：反应时间分别为10 min、0.5 h、2 h、 1 h、4h的反应液;M：蛋白质Maker

图11. 纤溶酶粗酶液体外对血凝块的溶解作用 a：溶栓时间2 h;b：溶栓时间10 h;c：溶栓时间24 h

图12. 纤溶酶粗酶液体外对血凝块的溶解作用 a：溶栓时间0 h;b：溶栓时间2 h;c：溶栓时间10 h;d：溶栓时间24 h 1：PBS溶液(pH 7.8);2：粗酶液;3：10倍稀释的粗酶液;4：尿激酶(256 IU/mL)

抗凝时间	PBS(pH 7.8)	粗酶液	10倍稀释粗酶液	尿激酶(256 IU/mL)
0.5 h	—	+	—	—
1 h	—	+	—	—
2 h	—	+	d+	d+
4 h	—	+	d+	d++:

表2. 纤溶酶粗酶液体外对血液凝固的影响

图13. 纤溶酶粗酶液体外对血液凝固的影响 a：抗凝时间0.5 h;b：抗凝时间1 h;c：抗凝时间2 h;d：抗凝时间4 h 1：粗酶液;2：10倍稀释的粗酶液;3：尿激酶(256 IU/mL);4：PBS溶液(pH 7.8)

图14. 纤溶酶粗酶液体外溶血试验

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He-Ne Laser Mutagenesis Increasing the Fibrinolytic Enzyme Activity of Bacillus subtilis

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