稗草EcHPPD基因的克隆及生物信息学分析

doi:10.11924/j.issn.1000-6850.casb2022-0789

中国农学通报 ›› 2024, Vol. 40 ›› Issue (3): 87-94.doi: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb2022-0789

稗草EcHPPD基因的克隆及生物信息学分析

韩进财¹(), 罗丁峰¹, 柏浩东², 李祖任¹()

¹ 湖南大学生物学院隆平分院，长沙 410125
² 杂草生物学及安全防控湖南省重点实验室，湖南人文科技学院，湖南娄底417000

收稿日期:2022-09-23 修回日期:2023-01-15 出版日期:2024-01-17 发布日期:2024-01-17
通讯作者:
李祖任，男，1987年出生，湖南郴州桂阳人，副研究员，博士，主要从事杂草生理生态与防控研究。通信地址：410125 湖南省长沙市芙蓉区远大二路892号湖南省农业科学院生物技术所杂草室，Tel：18273153504，E-mail：Lizuren88214@sina.com。
作者简介:
韩进财，男，1995年出生，河南开封人，硕士在读研究生，研究方向：杂草生理学。通信地址：410125 湖南省长沙市芙蓉区远大二路892号湖南省农业科学院生物技术所杂草室，Tel：18437923617，E-mail：1300587134@qq.com。
基金资助:
湖南省农业科技创新资金项目“耐除草剂作物种质资源创制与安全风险评估”(2022CX11); “稗草轻简高效防控关键技术研究与应用”(2022CX70); 湖南省旱粮产业技术体系“植保岗位专家”(2022-31)

EcHPPD Gene of Barnyard Grass: Cloning and Bioinformatics Analysis

HAN Jincai¹(), LUO Dingfeng¹, BAI Haodong², LI Zuren¹()

¹ Longping Branch, College of Biology, Hunan University, Changsha 410125
² Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Weeds, Hunan University of Humanities and Science, Loudi, Hunan 417000

Received:2022-09-23 Revised:2023-01-15 Published-:2024-01-17 Online:2024-01-17

摘要/Abstract

摘要：

旨在克隆稗草对羟基苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)基因为探究其基因功能提供基础，从而更好地开发除稗剂。以稗草叶片为材料，用同源克隆和cDNA末端快速克隆(RACE)技术克隆EcHPPD基因序列，用生物信息学软件分析其特征。EcHPPD基因的编码序列全长1317 bp，其编码蛋白质由439个氨基酸组成，相对分子质量为46.659 kD，等电点为5.30。稗草与同处禾本科的Dichanthelium oligosanthes (OEL23409.1: 8-249)的HPPD蛋白进化程度最为相近。EcHPPD三级建模蛋白结构由两条链构成，有2个Fe²⁺结合位点，并能与吡唑特活性中心骨架通过氢键相互作用。EcHPPD可能与HGO、HPT1、TAT3、AT5G36160、TAT7等11个蛋白产生互作。本研究报道了EcHPPD基因序列并对其进行了生物信息学分析，为创制新的HPPD抑制剂提供理论依据。

关键词: 稗草, HPPD基因, 基因克隆, 生物信息学, 蛋白互作

Abstract:

In order to clone the gene of hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase (HPPD) in Echinochloa crus-galli for exploring its genetic function and better developing herbicide, the homologous cloning and rapid amplification of cDNA ends (RACE) techniques were used to clone the EcHPPD gene sequence using E. crus-galli leaves as materials. The characteristics of EcHPPD were analyzed using bioinformatics software. The coding sequence of EcHPPD gene is 1317 bp in length, encoding a protein consisted of 439 amino acids with a relative molecular weight of 46.659 kD and an isoelectric point of 5.30. E. crus-galli is most evolutionarily close to Dichanthelium oligosanthes (OEL23409.1: 8-249) in the Poaceae family based on HPPD protein. The tertiary protein structure of EcHPPD is composed of two chains, with two Fe²⁺ binding sites, and can interact with the pyrazolide active center skeleton through hydrogen bonds. EcHPPD may interact with 11 proteins such as HGO, HPT1, TAT3, AT5G36160 and TAT7. This study reported the EcHPPD gene sequence and conducted bioinformatics analysis, providing a theoretical basis for creating new HPPD inhibitors.

Key words: barnyard grass, HPPD gene, gene cloning, bioinformatics, protein interaction

韩进财, 罗丁峰, 柏浩东, 李祖任. 稗草EcHPPD基因的克隆及生物信息学分析[J]. 中国农学通报, 2024, 40(3): 87-94.

HAN Jincai, LUO Dingfeng, BAI Haodong, LI Zuren. EcHPPD Gene of Barnyard Grass: Cloning and Bioinformatics Analysis[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2024, 40(3): 87-94.

图/表 8

Primer name	Primer sequence(5’-3’)	Use of primers
HPPD4-ZJ	Forward: TTCCACCACGTSGAGYTCTG Reverse: TCRTCCTTCTCCATGCACCC	Fragmen cloning
HPPD4-5GSP1	CGACGATGTGGTCGAACCGCCTG	5’RACE the first round of amplification
HPPD4-5GSP2	GTAGCTGACGTAGCGGAGCACGAC	5’RACE Second round of amplification
HPPD4-3GSP1	TGCTCGCCAACAACTCCGAGACC	3’RACE the first round of amplification
HPPD4-3GSP2	GCCGCAGCCAGATTCAGACGTACC	3’RACE Second round of amplification
R=A/G Degenerate bases were underlined, degenerate primers Y=C/T; R=A/G;

表1. EcHPPD核心序列PCR扩增引物

ddH₂O	17 μL
2×Phanta Max Buffer	25 μL
dNTP Mix (10 mmol/L each)	1 μL
Template DNA	2 μL
primer1 (10 μmol/L)	2 μL
primer2 (10 μmol/L)	2 μL
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymease(1 U/μL)	1 μL

表2. EcHPPD的保守序列PCR扩增体系

图1. PCR产物电泳胶图 A：EcHPPD基因核心保守序列凝胶电泳图；B：菌落PCR凝胶电泳图；M：DL 2000 DNA Marker

图2. EcHPPD基因序列及编码的氨基酸序列

图3. EcHPPD蛋白保守结构域预测及同源蛋白序列比对 A：EcHPPD蛋白保守域预测；B：EcHPPD与同源蛋白序列比对

图4. EcHPPD蛋白的系统进化分析（邻接法，1000次重复）

图5. EcHPPD蛋白三级结构预测及分子对接结果 A：EcHPPD蛋白三级结构预测；B：EcHPPD蛋白分子与吡唑特活性骨架虚拟对接

图6. EcHPPD蛋白互作预测及功能分析 A：EcHPPD蛋白与其他蛋白的互作关系图；B：EcHPPD蛋白分子具有的功能，1为L-tyrosine:2-oxoglutarate aminotransferase activity，2为Transaminase activity，3为Oxidoreductase activity，4为Pyridoxal phosphate binding，5为Transferase activity，6为Ion binding,7为Catalytic activity；C：EcHPPD蛋白参与的生物过程，1为Tyrosine catabolic process；2为L-phenylalanine catabolic process；3为Vitamin e biosynthetic process；4为Cellular amino acid metabolic process；5为Alpha-amino acid metabolic process；6为Carboxylic acid metabolic process；7为Organic hydroxy compound metabolic process；8为Biosynthetic process；9为Primary metabolic process

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