尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是重要农业致病菌与活性次级代谢产物资源真菌,高效稳定的原生质体转化体系是其基因功能研究与代谢调控的关键技术前提。为优化尖孢镰刀菌原生质体制备与转化体系,提高质粒转化效率;本研究以土大黄内生尖孢镰刀菌R1为材料,采用PEG介导转化法,通过单因素试验优化原生质体制备与转化条件;尖孢镰刀菌原生质体最佳制备条件为:CMC-Na培养基中产孢72 h,YEPD培养基中培养菌丝24 h,复合酶(崩溃酶: Yatalase: 溶菌酶=3: 1: 1,20 mg/mL)于36℃、 180 r/min、0.7 mol/L NaCl中酶解4 h,原生质体产量达3.81×107个/mL;以TB3为转化培养基,转化效率达27,000/mg(以单位质量的DNA转化子数计算)。应用研究表明,该体系成功敲除了镰刀菌R1内毒力因子fusarubin生物合成核心基因T1PKS,效率达62.5%;本研究构建了一套高产、稳定、高效的尖孢镰刀菌R1原生质体制备与PEG介导遗传转化体系,为该真菌的基因编辑、毒力机制解析、次级代谢产物挖掘及农业致病菌防控研究提供可靠技术支撑。