一株中华鳖源嗜水气单胞菌的分离鉴定及毒力基因分析

doi:10.11924/j.issn.1000-6850.casb2020-0484

中国农学通报 ›› 2021, Vol. 37 ›› Issue (20): 152-159.doi: 10.11924/j.issn.1000-6850.casb2020-0484

所属专题：生物技术；水产渔业

一株中华鳖源嗜水气单胞菌的分离鉴定及毒力基因分析

薛明洋¹(), 周勇¹, 梁宏伟¹, 李翔², 范玉顶¹, 曾令兵¹, 曲春娟³, 孟彦¹()

¹中国水产科学研究院长江水产研究所,武汉 430223
²安徽省喜佳农业技术有限公司,安徽蚌埠 233000
³安徽省蚌埠市水产技术推广中心,安徽蚌埠 233000

收稿日期:2020-09-22 修回日期:2021-01-21 出版日期:2021-07-15 发布日期:2021-08-06
通讯作者: 孟彦
作者简介:薛明洋,男,1991年出生,湖北十堰人,研究实习员,硕士,研究方向为水生动物病害防治。通信地址：430223 湖北省武汉市东湖新技术开发区武大园一路8号中国水产科学研究院长江水产研究所,Tel：027-81785198,E-mail：xmy@yfi.ac.cn。
基金资助:
国家“淡水水产种质资源库”(FGRC18537)

Isolation, Identification and Virulence Gene Analysis of an Aeromonas hydrophila from Diseased Pelodiscus sinensis

Xue Mingyang¹(), Zhou Yong¹, Liang Hongwei¹, Li Xiang², Fan Yuding¹, Zeng Lingbing¹, Qu Chunjuan³, Meng Yan¹()

¹Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuhan 430223
²Anhui XiJia Agricultural Technology Co., LTD., Anhui Bengbu 233000
³Bengbu Aquatic Technology Promotion Station, Anhui Bengbu 233000

Received:2020-09-22 Revised:2021-01-21 Online:2021-07-15 Published:2021-08-06
Contact: Meng Yan

摘要/Abstract

摘要：

为了确定安徽某中华鳖养殖场导致中华鳖发病的病原,为今后生产中有效防控该疾病提供参考。本研究无菌条件下从患病中华鳖体内分离病原,通过形态学、生理生化特征和16SrDNA序列分析对病原菌进行鉴定;利用回归感染试验对病原菌致病性进行确定,采用琼脂扩散法进行药敏试验,并对病原的毒力基因进行分析。结果从患病中华鳖体内分离纯化得到一株致病菌,命名为AM-1,经鉴定该菌为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila);用该菌进行人工感染得到的症状与自然发病中华鳖症状一致;该菌对恩诺沙星和左氧氟沙星等药物敏感,对复方新诺明、氨苄西林和四环素等不敏感。毒力基因检测显示,该嗜水气单胞菌AM-1分离株携带气溶素、热不稳定性肠毒素、热稳定性肠毒素、溶血素、弹性蛋白酶5种毒力基因。最终表明嗜水气单胞菌AM-1是引起此次中华鳖发病的病原,可以使用恩诺沙星和左氧氟沙星等药物进行防治。

关键词: 中华鳖, 嗜水气单胞菌, 毒力基因, 致病性

Abstract:

The study aims to determine the pathogen causing disease in a Chinese soft-shelled turtle farm in Anhui Province, and provide reference for effective prevention and control of the disease in future production. The pathogenic bacteria were isolated from the moribund turtle with typical symptoms under aseptic condition, and then were identified by the morphological examination, biochemical analysis, and sequence analysis of bacterial 16S rDNA. The drug susceptibility test was conducted by Kirby-Bauer agar diffusion method, and the virulence genes of the pathogen were analyzed. The results showed that the pathogen was identified as Aeromonas hydrophila, called AM-1. Artificial infection showed that the typical symptoms of the disease could be replicated as the ones naturally occurred and this bacterium was of high pathogenicity to Chinese soft-shelled turtle. The drug resistance tests showed that the isolated pathogen was highly sensitive to enrofloxacin and levofloxacin, while extremely resistant to cotrimoxazole, ampicillin and tetracycline. The amplification results of 6 virulence genes showed that the isolated pathogen carried 5 virulence genes including aerolysin, heat-labile enterotoxin, heat-stable enterotoxin, hemolysin and elastase. This study indicates that Aeromonas hydrophila AM-1 is the pathogenic bacteria which could cause the deadly disease outbreak of the Chinese turtle. Enrofloxacin and levofloxacin can be used for treatment.

Key words: Pelodiscus sinensis, Aeromonas hydrophila, virulence gene, pathogenicity

中图分类号:

S941

薛明洋, 周勇, 梁宏伟, 李翔, 范玉顶, 曾令兵, 曲春娟, 孟彦. 一株中华鳖源嗜水气单胞菌的分离鉴定及毒力基因分析[J]. 中国农学通报, 2021, 37(20): 152-159.

Xue Mingyang, Zhou Yong, Liang Hongwei, Li Xiang, Fan Yuding, Zeng Lingbing, Qu Chunjuan, Meng Yan. Isolation, Identification and Virulence Gene Analysis of an Aeromonas hydrophila from Diseased Pelodiscus sinensis[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2021, 37(20): 152-159.

图/表 9

参考文献 29

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目的基因	引物序列(5’-3’)	退火温度/℃	长度/bp
STIV	F: GACTTGGCCACTTATGAC	52	531
STIV	R: GTCTCTGGAGAAGAAGAA	52	531
16S rDNA	F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG	55	1500
16S rDNA	R: GGTTACCTTGTTACGACTT	55	1500
aero	F: CAAGAACAAGTTCAAGTGGCCA	57	309
aero	R: ACGAAGGTGTGGTTCCAGT	57	309
hly	F: TGACAGGCAAGTAGAATAACGC	58	1815
hly	R: TGTCCGCTTTCCACTCCC	58	1815
ahp	F: GTTAGCGTTGGCAATCTCG	57	874
ahp	R: CGCTGGAGTAGGAGGAACG	57	874
alt	F: TGACCCAGTCCTGGCACGGC	57	442
alt	R: GGTGATCGATCACCACCAGC	57	442
ast	F: ATCGTCAGCGACAGCTTCTT	58	504
ast	R: CTCATCCCTTGGCTTGTTGT	58	504
act	F: TACCACCACCTCCCTGTCGC	60	249
act	R: ATGCTGCTCGCCTTGTGGTT	60	249

目的基因	引物序列(5’-3’)	退火温度/℃	长度/bp
STIV	F: GACTTGGCCACTTATGAC	52	531
STIV	R: GTCTCTGGAGAAGAAGAA	52	531
16S rDNA	F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG	55	1500
16S rDNA	R: GGTTACCTTGTTACGACTT	55	1500
aero	F: CAAGAACAAGTTCAAGTGGCCA	57	309
aero	R: ACGAAGGTGTGGTTCCAGT	57	309
hly	F: TGACAGGCAAGTAGAATAACGC	58	1815
hly	R: TGTCCGCTTTCCACTCCC	58	1815
ahp	F: GTTAGCGTTGGCAATCTCG	57	874
ahp	R: CGCTGGAGTAGGAGGAACG	57	874
alt	F: TGACCCAGTCCTGGCACGGC	57	442
alt	R: GGTGATCGATCACCACCAGC	57	442
ast	F: ATCGTCAGCGACAGCTTCTT	58	504
ast	R: CTCATCCCTTGGCTTGTTGT	58	504
act	F: TACCACCACCTCCCTGTCGC	60	249
act	R: ATGCTGCTCGCCTTGTGGTT	60	249

检测项目	AM-1	嗜水气单胞菌	检测项目	AM-1	嗜水气单胞菌
葡聚糖 Glucan	+	+	明胶 Gelatin	+	+
D-麦芽糖 D-Maltose	+	+	异硫氰酸胍 GuSCN	+	+
蔗糖 Sucrose	+	+	果胶 Pectin	+	+
α-D-乳糖α-D-Lactose	+	+	粘酸 Mucic Acid	+	+
D-甘露糖 D-Mannose	+	+	奎宁酸 Quinic Acid	+	+
D-果糖 D-Fuctose	+	+	D-苹果酸 D-Malic Acid	–	+
夫西地酸 Fusidic Acid	–	–	L-苹果酸L-Malic Acid	–	–
D-丝氨酸 D-Serine	+	+	氯化锂Lithium Chloride	+	+
D-甘露醇 D-Mannitol	+	+	萘啶酮酸Nalidixic Acid	+	+
D-水杨苷 D-Salicin	d	–	D-葡萄糖 D-Glucose	d	–
丙三醇 Glycerol	+	+	γ-氨基丁酸 γ-ABA	+	+
肌醇Myo-lnositol	+	+	α-羟基丁酸α-HBA	–	–

检测项目	AM-1	嗜水气单胞菌	检测项目	AM-1	嗜水气单胞菌
葡聚糖 Glucan	+	+	明胶 Gelatin	+	+
D-麦芽糖 D-Maltose	+	+	异硫氰酸胍 GuSCN	+	+
蔗糖 Sucrose	+	+	果胶 Pectin	+	+
α-D-乳糖α-D-Lactose	+	+	粘酸 Mucic Acid	+	+
D-甘露糖 D-Mannose	+	+	奎宁酸 Quinic Acid	+	+
D-果糖 D-Fuctose	+	+	D-苹果酸 D-Malic Acid	–	+
夫西地酸 Fusidic Acid	–	–	L-苹果酸L-Malic Acid	–	–
D-丝氨酸 D-Serine	+	+	氯化锂Lithium Chloride	+	+
D-甘露醇 D-Mannitol	+	+	萘啶酮酸Nalidixic Acid	+	+
D-水杨苷 D-Salicin	d	–	D-葡萄糖 D-Glucose	d	–
丙三醇 Glycerol	+	+	γ-氨基丁酸 γ-ABA	+	+
肌醇Myo-lnositol	+	+	α-羟基丁酸α-HBA	–	–

菌液浓度/(CFU/mL)	数量	死亡数量								合计	死亡率/%
菌液浓度/(CFU/mL)	数量	1 d	2 d	3 d	4 d	5 d	6 d	7 d	8 d	合计	死亡率/%
1×10⁶	8	0	0	2	2	2	0	0	0	6	75
1×10⁷	8	0	1	3	2	1	0	0	0	7	87.5
1×10⁸	8	0	1	4	2	0	0	0	0	7	87.5
1×10⁹	8	0	3	3	2	0	0	0	0	8	100
1×10¹⁰	8	0	4	3	1	0	0	0	0	8	100
0	8	0	0	0	0	0	1	0	0	1	12.5

一株中华鳖源嗜水气单胞菌的分离鉴定及毒力基因分析

Isolation, Identification and Virulence Gene Analysis of an Aeromonas hydrophila from Diseased Pelodiscus sinensis

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左氟沙星	25	S	四环素	9	R
克林霉素	6	R	妥布霉素	6	R
氯霉素	6	R	多粘菌素	12	I
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复方新诺明	6	R	米诺环素	6	R
青霉素G	6	R	氨苄西林	10	R

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