Optimization of HPLC Conditions for Analysis of Hirudin

doi:10.11924/j.issn.1000-6850.casb2023-0423

Abstract

Abstract:

In order to study the optimal chromatographic conditions for the HPLC analysis of hirudin, we compared the elution conditions, detection wavelengths and separation effects of the HPLC methods for recombinant hirudin, fitted the linear equations of hirudin concentration and peak area, and optimized the hirudin chromatographic analysis conditions. The results showed that the optimal conditions for the analysis on the ODSC₁₈column were as follows: gradient elution, mobile phases A and B elution program: 0~60 min, B: 0%~100%, injection volume of 20 μL, column temperature of 35℃, flow rate of 1 mL/min, and wavelength of 205 nm. And the optimal conditions for the analysis on the TSKgelG2000SW column were as follows: mobile phase’s phosphate buffer (0.02 mol/L, pH 7.0), flow rate of 0.5 mL/min, and wavelength of 205 nm, injection volume of 20 μL. The study showed that the concentration of hirudin had a good linear correlation with the peak area, and the analytical effect of the TSKgelG2000SW column was better than that of the ODSC18 column, which could be used for the analysis of the active peptides in animals.

Key words: Hirudin, HPLC, chromatographic column, chromatographic conditions, separation effect

HUANG Wei, DENG Bin, WANG Yixian, CHEN Kang, RAO Rongtong, YANG Xiujuan. Optimization of HPLC Conditions for Analysis of Hirudin[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2024, 40(11): 142-147.

Figures/Tables 13

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梯度洗脱	流动相组成	洗脱程序
1	A：水（含0.1%TFA） B：60%乙腈（含0.1%TFA）	0~30 min：0~20%B 30~60 min：20%~50%B 60~90 min：50%~80%B
2	A：水（含0.1%TFA） B：60%乙腈（含0.1%TFA）	0~20 min：0~20%B 20~40 min：20%~50%B 40~90 min：50%~80% B
3	A：水（含0.1%TFA） B：60%乙腈（含0.1%TFA）	0~90 min：0~100%B
4	A：水（含0.1%TFA） B：60%乙腈（含0.1%TFA）	0~60 min：0~100%B

梯度洗脱	流动相组成	洗脱程序
1	A：水（含0.1%TFA） B：60%乙腈（含0.1%TFA）	0~30 min：0~20%B 30~60 min：20%~50%B 60~90 min：50%~80%B
2	A：水（含0.1%TFA） B：60%乙腈（含0.1%TFA）	0~20 min：0~20%B 20~40 min：20%~50%B 40~90 min：50%~80% B
3	A：水（含0.1%TFA） B：60%乙腈（含0.1%TFA）	0~90 min：0~100%B
4	A：水（含0.1%TFA） B：60%乙腈（含0.1%TFA）	0~60 min：0~100%B

色谱柱	ODSC18柱	TSKgelG2000SW柱
峰面积测定值	12744013	65565155
	11854013	62765996
	12041143	64026913
	12650003	61625896
	12195138	64025897
	11954755	61725894
平均值	12239844.17	63289291.83
RSD/%	2.78	2.21

色谱柱	ODSC18柱	TSKgelG2000SW柱
峰面积测定值	12744013	65565155
	11854013	62765996
	12041143	64026913
	12650003	61625896
	12195138	64025897
	11954755	61725894
平均值	12239844.17	63289291.83
RSD/%	2.78	2.21