【研究目的】探讨胰岛素样生长因子(IGF1)对生长60 d的梅花鹿鹿茸体外培养不同代数鹿茸生长中心细胞的影响。【方法】分离、培养生长60d的梅花鹿鹿茸生长中心细胞,将培养第2 代、5 代、8 代细胞经含有不同浓度的IGF1(0,1,3 和10 nM)作用,在培养24 h后用3H-胸腺嘧啶核苷掺入测定法检测每分钟衰变数(DPM)值。【结果】全部IGF1处理组都显著高于对照组(p<0.01)。不同浓度IGFⅠ处理组的平均值和最高值都是离体培养2 代的细胞的DPM最高(分别为31918和39818 DPM/mg蛋白),培养5 代的细胞(分别为5455和6815 DPM/mg蛋白)已大大地下降;到了第 8代的(分别为4030和4838 DPM/mg蛋白)又有进一步的下降。【结论】IGF1能够促进鹿茸生长中心细胞分裂增殖,生长60 d鹿茸的生长中心细胞在离体培养,不同培养时期的鹿茸生长中心细胞对IGFⅠ刺激的敏感度不同。
用水煮醇沉法提取板蓝根多糖,通过观察PK-15细胞病变效应(CPE)来评价板蓝根多糖的不同加药方式体外对猪细小病毒(PPV)的阻断和抑制作用。结果表明板蓝根多糖在对细胞的安全浓度范围内,对猪细小病毒有明显的阻断作用和抑制的作用,最小的阻断浓度为2.09μg/ml,最小的抑制浓度为4.19μg/ml。
根据GenBank发表的犬瘟热病毒N基因全序列,设计合成了1对特异扩增CDV N基因的引物。以山东泰安分离的CDV-FOX-TA株细胞毒中提取病毒RNA来制模板,利用RT-PCR扩增出了1.6kb的N基因,将其克隆到pIREShyg载体上,构建了pIRES-N真核表达载体。然后通过磷酸钙共沉淀法转染CHO-K1细胞,通过潮霉素筛选得到阳性克隆,间接免疫荧光实验(IFA)鉴定N基因在CHO细胞中的表达,并用RT-PCR方法从转录水平证实N基因在CHO-K1细胞中的表达,最终建立了CHO/ CDV-N细胞株,为犬瘟热病毒的血清学检测和基因疫苗的研制奠定了基础。
研究了离子霉素处理时间、处理浓度和不同胚胎基础培养基对猪无透明带卵孤雌激活的影响。结果表明:(1)10 μM离子霉素处理5 min、7 min、10 min的激活率64.81%、66.67%、68.75%差异不显著(P>0.05),但显著高于处理3 min的激活率36.17%。(2)分别以10 μM、15 μM离子霉素处理10 min的激活率68.18%、65.11%差异不显著(P>0.05),但显著高于5 μM的激活率40.54%(P<0.05)。(3)分别以NCSU-23+4%BSA和TCM199+4%BSA作为基础培养基进行培养,其激活率68.51%、62.50%无显著差异(P>0.05)。试验结果表明:10 μM离子霉素处理5 min联合2 mmol/L6-DMAP处理2 h激活, 以NCSU-23+4%BSA为胚胎基础培养基能有效提高猪无透明带卵孤雌激活的激活率。
分别采用冷冻法、酸析法、有机溶剂法和化学混凝法等方法提取丝胶蛋白并制备丝胶蛋白粉,测定并比较它们的物理特性。结果表明:冷冻法提取丝胶蛋白的回收较高;无水乙醇法结合离心法制出的丝胶蛋白粉物理性质良好,其持水性、持油性和溶解性都好于其它方法制备的丝胶蛋白粉,表现出良好的加工性能。
研究口蹄疫146S病毒粒子抗原(FMDV 146S)对乳鼠心肌膜微血管内皮细胞(RMMVECs)分泌IL-6的影响,为解决现有口蹄疫疫苗的不足提供数据。体外培养乳鼠心肌膜微血管内皮细胞,用ELISA方法检测FMDV 146S处理后细胞上清液中IL-6浓度。乳鼠心肌膜微血管内皮细胞(RMMVECs)在正常状态下低水平分泌IL-6;FMDV 146S刺激后IL-6的分泌量显著增加,且呈剂量和时间依赖性,在刺激24 h后分泌量达到峰值。MVECs在FMDV 146S诱导的免疫与炎症反应中起着重要作用。
选择牛23号染色体上4个微卫星标记BM1818、BM1443、BM1258 和BM1905,用非变性聚丙酰胺凝胶电泳方法对石河子某奶牛场150头进口荷斯坦奶牛进行了遗传变异的检测分析并计算相应的遗传指标,利用SPSS12.0 软件分析了四个微卫星座位与进口荷斯坦牛隐性乳房炎的关系,探讨各自座位上不同基因型与奶牛隐性乳房炎之间的相互关系。
摘 要:在药用植物中开展分子生物学研究时的常见困难是RNA提取困难,提取的RNA质量不能满足下一步试验要求。探索了一种适用于地黄不同组织器官的RNA提取方法并对提取的RNA质量在随后的分子生物学中进行了检验。结果证实通过该方法提取的RNA纯度和完整性较好,完全可以满足后续的分子生物学实验要求,也可以作为其它药用植物RNA提取的参考方法。
以橡胶林土壤为材料,直接提取土壤微生物DNA。研究表明,本实验介绍的方法不仅可以获得大片段,并且不需要纯化即可直接用于PCR扩增和DNA酶切等后续操作,每克土壤DNA提取量约为2.1~4.6μg。此方法操作简单、快捷、为土壤宏基因组文库的构建和土壤微生物群落结构的多样性分析提供基础。
以花生品种丰花3号为材料,研究了花生SSR技术中PCR反应体系的主要成分对SSR 扩增效果的影响及不同引物的退火温度。结果表明dNTP 对扩增影响较大,每对引物都有其扩增适合的退火温度。确立了适合花生SSR 分子标记研究的优化体系。最终确定总反应体系为20 μl,其中25 mM MgCl2 1.5 μl,2.5 mM dNTP 1.6 μl,5 U/μl Taq 酶 0.17 μl,100 ng/μl模板DNA 0.4 μl,2.5 mM 引物 5 μl。优化后的扩增程序退火温度为54℃。
以银耳芽孢为材料,由载体pEGFP、pCAMBIA1300经过Hind III和EcoRⅠ双酶切、连接、转化,重组质粒酶切验证,笔者成功构建了由双孢蘑菇gpd启动子调控EGFP基因的银耳真核表达载体,命名pCB-BEGFP。采用电击转化法将携带EGFP基因的银耳表达载体pCB-BEGFP转化到银耳芽孢。提取4个转化子基因组DNA,用EGFP基因特异引物 PCR扩增,电泳结果表明有与EGFP基因大小一致的特异带出现;荧光显微镜观察在再生培养基上的转化子可看到很强的绿光;其中一个转化子蛋白SDS-PAGE电泳,结果发现在大约27kD处有一明显的蛋白条带出现,与预期的蛋白分子量相近。以上结果证明EGFP基因转入银耳芽孢中,双孢蘑菇启动子可以调控外源基因的在银耳芽孢中正确表达。
利用ISSR标记对34份樱桃种质资源进行遗传多样性检测。结果发现,ISSR标记能够揭示材料间较高的遗传多样性。每个引物可获得6~12条DNA片段,平均为8.76条;17个ISSR引物共扩增出149条DNA片段,其中143条具有多态性,多态性比率(PPB)为95.97%;平均多态信息量(PIC)为0.90;每个位点有效等位基因数(Ne)为1.914;材料间遗传相似系数GS变幅为0.44~0.91,平均达0.73。通过聚类,从分子水平对樱桃种质资源的遗传关系进行分析,并对34份资源进行分类,ISSR标记能将34份樱桃种质完全区分开,为樱桃种质资源的研究利用提供参考。
四倍体小麦与节节麦杂交培育的人工合成六倍体小麦已广泛应用于国内外小麦品种改良。以引自CIMMYT的Syn768、Syn769和Syn780人工合成六倍体小麦分别与中国四川成都平原主栽普通小麦品种杂交、回交的BC2F2:6后代群体中选育的113份优良高代系为材料,采用SSR特异引物的PAGE凝胶电泳对其Waxy蛋白亚基缺失类型进行了研究。结果表明,在所检测的121份材料中,8份材料缺失Waxy-B1型蛋白亚基,占全部材料的6.6%;没有检测到其他类型的缺失体。从每个人工合成六倍体小麦亲本材料所形成的后代衍生群体来看, Waxy-B1缺失体频率各不相同,说明Waxy蛋白亚基缺失类型在人工合成六倍体小麦后代衍生群体材料中的表现存在着随机性,与亲本的基因型状况关系极大。通过研究人工合成六倍体小麦与普通小麦杂交后代的Waxy蛋白亚基缺失类型,有助于提高分子标记育种效率。
利用传统的基因缺失产生的突变体的方法来鉴定基因的功能效率很低,因为对于发育早期的基因特别是配子发育相关的基因以及冗余基因,这种突变体显得无能为力,前者基因纯合突变体导致死亡、而后者由于冗余基因之间的功能互补而不显示任何表型。而通过基因激活标签技术可以获得显性突变体即功能获得型突变体,为研究这类基因的功能提供了一个重要的手段。基因激活标签技术是指含有35S增强子或启动子的T-DNA或转座子若插入基因内, 可导致插入突变,引起插入失活突变体的产生;若插入基因附近(上游或下游),则可能激活正常情况下不表达或表达极弱的基因,导致显性功能获得(dominant gain-of-function)性突变。近年来通过T-DNA或转座子介导的方法建立了多种植物的基因激活标签突变体库,在植物基因功能研究中发挥了重要作用,使一些由多个基因或基因家族决定的功能的研究获得突破性进展。本文主要就植物基因激活标签技术的原理,特点和创制方法以及在植物生长发育、代谢等一系列方面研究中的应用进行了阐述,并对该技术的发展趋势进行了较为详细的探讨。
1School of Life Science, Northwest A & F University, Yangling 712100; 2Wuhan Institute of Vegetable Science, Wuhan 430065
为探讨改良SDS法是否适用于杏基因组DNA提取及提取液适宜浓度,以6个品种杏叶片为试材提取DNA,提取液设0.5%、1%、2%三个浓度梯度。检测结果表明,改良SDS法完全适用于杏叶片基因组DNA的提取,3种浓度的提取液均可得到质量较高的DNA, 且0.5%为改良SDS法提取杏叶片基因组DNA的适宜提取液浓度。
【研究目的】克隆玉米分支酶基因SBEⅡb并构建该基因的过表达载体pCASBEⅡb。【研究方法】从糯玉米(Waxy corn)新鲜胚乳中提取总RNA,利用RT-PCR方法克隆玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA。【结果】克隆得到了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA,用BLAST软件作同源序列比对的结果显示,该片段的核苷酸序列与GenBank上报道的序列具有99%的同源性,全长2719bp,编码799个氨基酸。【结论】将该基因连接到携带GUS报告基因的植物表达载体pCAMBIA1303中,并通过了GUS活性检测,说明已成功构建了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的过表达载体pCASBEⅡb。
以碗莲‘案头春’茎尖为实验材料,对诱导培养基成份、培养基状态、最佳取材时期以及增殖培养基筛选等方面进行了研究。结果表明:最佳取材季节为10~12月份;碗莲茎尖分化最适宜培养基为MS + 1.0 mg/L 6-BA +0.25 mg/L NAA +1.0 mg/LGA3;适宜的增殖培养基为MS +2.0 mg/L 6-BA +0.25 mg/L NAA;固液培养状态:上层为5mm厚的MS + 1.0 mg/L 6-BA + 0.25 mg/L NAA + 1.0 mg/L GA3液态培养基,下层为1cm厚的MS + 1.0 mg/L 6-BA +0.25 mg/L NAA + 1.0 mg/L GA3固态培养基,更有利于芽诱导;培养过程中污染的芽苗用75%酒精1min、0.1%HgCl210min灭菌效果最好。
本文利用CAPS和SSR两种分子标记技术,对野生种多毛和醋栗番茄与栽培种番茄的DNA指纹图谱进行了分析。结果表明,30对CAPS和10对SSR引物中,分别有19对和7对引物产生清晰明显且稳定的多态性条带。利用两种标记共获得了98个标记位点,分析表明SSR标记的检测效率高于CAPS标记。相对于栽培种而言,多毛番茄有16.3%的特异信息,醋栗番茄有10%的特异信息。该些标记为番茄遗传图谱的构建、重要基因的标记及遗传育种提供了有力工具。
以青岛百合叶片为外植体,研究了消毒时间、培养基、生长调节物质对青岛百合叶片不定芽发生、增殖和生根的影响。结果表明:用0.1%氯化汞对青岛百合叶片消毒5 min时效果最好,污染率为31%,萌动率为79%,诱导率为65.2%。青岛百合最佳叶片不定芽分化培养基为MS+6-BA2.0 mg/L+NAA 0.2mg/L;最佳不定芽增殖培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2mg/L;最佳生根的培养基为1/2MS+NAA 0.2 mg/L,形成了较为完善的组织培养再生体系。
根据已发表的拟南芥启动子序列(AF248988)设计合成一对引物,以拟南芥(Arabidopsis)基因组DNA为模板,通过PCR技术获得了约含500 bp大小的DNA片段,经纯化后测序得到531 bp的目的片段。通过DNAman进行序列分析表明,与文献报道的PCHS启动子序列有99%的同源,含有四个花特异表达的调控元件。将此启动子替换pBI121上的CaMV35S启动子构建植物表达载体,农杆菌介导法浸染矮牵牛花、茎、叶、根。GUS瞬时表达结果表明,在花上出现较深的蓝色,而在茎上的蓝色很浅,在根和叶中不显蓝色,初步确定该启动子具有较强的花特异表达特性。
采用Trizol法提取高质量小麦总RNA,并运用RT-PCR方法克隆了小麦GAPDH (甘油醛三磷酸脱氢酶)基因的部分序列(EU022331),长度为604 bp,核苷酸序列比对结果表明,该序列与大麦(M36650)、玉米(AY109397)、番茄(BT012693)GAPDH核苷酸序列的同源性分别为95%、86%和84%。GAPDH基因的克隆为在禾谷类作物研究的应用提供了一个较好的对照基因。
黄秋葵细胞内含有丰富的果胶类多糖等次生物质,降低了从中提取总DNA的产量和质量。为了获得高质量的基因组DNA,采用改进的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法进行提取,并对总DNA进行了纯度和浓度的鉴定。结果表明,改良的CTAB法可有效去除次生物质对DNA的干扰,降低DNA的粘稠度,样品DNA的质量和纯度较高,可用于随机扩增多态性DNA(RAPD)扩增等分子标记分析。
为了研究转基因小麦是否会对人类健康存在潜在的不良影响,分别用转PSAG12-IPT基因西农1376小麦与普通西农1376小麦饲喂小白鼠,对两组小白鼠的亲代和子代的血常规,血液生化指标进行了检测,并分别解剖取其肝脏、肾脏、大肠、肺脏、大脑、睾丸等组织作切片观察。结果表明:饲喂转基因小麦的处理组和对照组小白鼠的各项指标相比较均无显著性差异,说明转PSAG12-IPT基因小麦对小白鼠的健康无明显的不良影响,初步推断食用转PSAG12-IPT基因小麦对人类也可能是安全的。
逆境对于水稻产量和品质有很大影响,研究在逆境下水稻基因的表达变化对于研究水稻抗逆有着重要意义。该实验运用荧光差异显示(Fluorescence Differential Display, FDD)技术,从低温处理的水稻中克隆到OsRAN1基因并通过半定量PT-PCR分析该基因在低温和高盐逆境下的表达。该基因cDNA序列全长为984bp,含有一个编码221个氨基酸残基的开放阅读框,推测分子量为25.0 KD,此氨基酸序列具有GTPase活性区域,属于小G蛋白Ran亚家族,通过氨基酸相似性比对发现,Ran家族氨基酸序列高度保守,OsRAN1与TaRAN1和AtRAN1相似性分别达到98.19%和92.76%。通过半定量PT-PCR分析,发现在低温胁迫下,OsRAN1在根和叶鞘中表达量均有增加,尤其是高盐胁迫下根中OsRAN1表达量有迅速升高然后降低的变化。推测该基因在水稻逆境应答中起着重要作用。
【研究目的】研究西瓜材料之间的亲缘关系及其分类,为进一步利用和创新材料、培育新的品种提供依据;【方法】采用SRAP技术对64份西瓜种质资源的遗传多样性进行了研究;【结果】从700多个引物组合中筛选出了51个条带清晰、多态性高的引物组合来分析供试材料,共产生431条扩增带,其中243条带具有多态性,多态性频率平均为56.4%,除去非洲野生型57号材料,其它材料间多态率为39.4%。将243条多态性SRAP条带,利用NTSYS软件计算了64个材料间的遗传相似系数,其变化范围为0.47~0.97,除非洲野生型材料57号等4个差异较大的材料,其它材料间变化范围仅为0.87~0.97;【结论】说明目前西瓜育种的大多数材料间同源性较高,遗传分化较小,其遗传基础非常狭窄。该研究结果对利用特殊种质、合理选择杂交亲本具有一定的参考价值。
对玉米和小麦种子休眠性QTL(Quantitative Trait Locis)的比较研究结果表明:玉米和小麦种子休眠性QTL在染色体上的分布表现出了高度的同源性。分析发现在玉米第1、3和8染色体上已定位了的7个种子休眠性QTL,在与之同源的小麦染色体上均有种子休眠性QTL的分布。这种同源性关系将有助于研究和理解玉米及整个禾本科作物基因组的构成和进化。
【研究目的】抗生素是某些微生物在生长代谢过程中产生的次级代谢产物,具有抑制或杀死微生物的能力[1]。根据抑菌带的长短,即可判断氨苄西林对不同细菌的影响以及不同浓度氨苄西林对同一种菌的影响,初步判断其抗菌谱。【方法】采用滤纸条法测定氨苄西林的抗菌谱,选用的菌种为金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,枯草芽孢杆菌。【结果】随着氨苄西林浓度的增加,抑菌带的长度逐渐增长,抑菌效果越来越强,但同一浓度的氨苄西林对金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,枯草芽孢杆菌的抑制效果差别不是很明显。【结论】氨苄西林通过抑制转肽作用使细菌的细胞壁解体而死亡。
通过荧光差异显示(fluorescent differential display,FDD)以及RT-PCR技术,得到一个水稻核糖体蛋白基因。该基因的cDNA全长为565 bp,编码一个具有134个氨基酸残基的多肽,推测分子量是15.4 kD。与其他植物中核糖体蛋白L14的相似性为82.84%~88.06%,命名该基因为OsRPL14。在低温(8℃)及干旱条件处理下,该基因表达量在根和茎中都有比较明显的增加趋势。推测该基因在逆境反应中起着重要作用。
采用正相高效液相色谱法同时分离和测定生育酚和生育三烯酚的含量,确定一种简单准确测定维生素E异构体含量的方法。样品经前处理后,用Zorbax NH2柱分离,以正己烷-异丙醇为流动相洗脱,在波长292 nm处进行检测,采用外标法对七种维生素E异构体:α-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育酚、γ-生育酚、γ-生育三烯酚、δ-生育酚和δ-生育三烯酚进行了定量分析。结果表明,各组分线性关系良好(相关系数0.9993~0.9998),精密度高,稳定性和重现性好,加样回收率在97.0%~102.1%,方法简便准确,可用于不同样品的定量分析。
就微波提取火龙果果皮天然红色素的工艺进行探讨。采用单因素和正交试验,研究微波功率、提取时间、料液比对色素提取的影响,确定微波提取火龙果果皮红色素的最佳工艺条件,并与传统溶剂浸提法进行比较。结果发现,微波萃取的最佳条件为:以纯净水为溶剂,微波功率60%(480W),提取时间80s、料液比(g:ml)1:3,提取次数为3次。微波提取火龙果色素的效果明显优于常规的溶剂浸提法。
为了评价不同品种山楂果实的营养品质,筛选出营养丰富、满足不同需求的品种,为山楂品质育种提供参考,测定了11个山楂品种的营养成分,对其营养品质进行了综合分析。结果表明,不同山楂品种的总酸度、可溶性蛋白、可溶性糖和维生素C含量差异明显,其变幅依次为1.625%~3.061%,5.165~8.714mg/g,6.610%~28.110%,55.87~139.70mg/g。综合营养品质最好的品种是燕瓤红,营养品质最差的是敞口。