Establishment and Optimization of SSR-PCR Reaction System of Apple Plants

doi:10.11924/j.issn.1000-6850.casb20200100068

Abstract

Abstract:

To establish an optimal SSR-PCR system for apple plants, the L₁₆(4⁵) orthogonal test and the annealing temperature gradient experiment were used to analyze the effect of template concentration, primer concentration, Mg²⁺concentration, dNTPs concentration and Top Taq enzyme concentration in the SSR reaction system on the amplification products. Additionally, the above five factors were screened and optimized at 4 different levels. The results showed that the primer concentration factor had the greatest impact on the SSR-PCR reaction system. Though analysis, the optimal reaction system of 25 μL for SSR-PCR was finally determined to be as follows: 30-60 ng DNA template, 1.2 μL forward and reverse primer (5 μmol/L), 0.5 μL dNTPs (2.5 mmol/L), 0.5 μL Top Taq enzyme (2.5 U/μL) and 2.5 μL 10×Top Taq buffer (containing Mg²⁺). Finally, optimized reaction system was used for PCR amplification using 21 different apple plants, and the amplification products were about 100-200 bp displaying 2-3 alleles. The optimal SSR-PCR reaction system can provide a preliminary basis for the genetic variation research and molecular identification of genetic relationships in different populations of apple plants.

Key words: apple, SSR-PCR optimal reaction system, orthogonal design experiment, germplasm resource, single factor test

CLC Number:

S661.1

Liu Lin, Sun Xiaoshuai, Li Qian, Fan Shuchen, Shi Hongdi, Ma Jun, Liu Dandan. Establishment and Optimization of SSR-PCR Reaction System of Apple Plants[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2021, 37(1): 61-66.

Figures/Tables 10

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编号	品种	编号	品种	编号	品种
1	德国红星	8	金帅	15	北斗
2	华艳	9	美国8号	16	新红王将
3	金世纪	10	中秋王	17	红蛇
4	红元帅	11	密脆	18	国光
5	乔纳金	12	假红肉	19	华美
6	中原	13	华丹	20	皮诺娃
7	烟富3	14	七月红	21	粉红女士

编号	品种	编号	品种	编号	品种
1	德国红星	8	金帅	15	北斗
2	华艳	9	美国8号	16	新红王将
3	金世纪	10	中秋王	17	红蛇
4	红元帅	11	密脆	18	国光
5	乔纳金	12	假红肉	19	华美
6	中原	13	华丹	20	皮诺娃
7	烟富3	14	七月红	21	粉红女士

引物名称	F(5’-3’)	R(3’-5’)
CH03d11	ACCCCACAGAAACCTTCTCC	CAACTGCAAGAATCGCAGAG
CH01h02¹	AGAGCTTCGAGCTTCGTTTG	ATCTTTTGGTGCTCCCACAC

引物名称	F(5’-3’)	R(3’-5’)
CH03d11	ACCCCACAGAAACCTTCTCC	CAACTGCAAGAATCGCAGAG
CH01h02¹	AGAGCTTCGAGCTTCGTTTG	ATCTTTTGGTGCTCCCACAC

水平	因素
水平	模板DNA浓度/(ng/μL)	引物浓度/(μmol/μL)	Top Taq buffer(Mg²⁺)/(μmol/μL)	dNTPs/(μmol/μL)	Top Taq/(U/μL)
1	2.25	1.50	2.25	2.50	2.50
2	2.25	3.00	3.00	2.50	2.50
3	2.50	2.75	2.50	2.25	2.25
4	3.00	3.00	2.25	2.50	2.00